ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）のプロトコル

 

ノイラミニダーゼのプロトコル

ノイラミニダーゼ（製品番号 10269611001）を使用した精製リポオリゴ糖（LOS）からのシアル酸の除去

本酵素は、タンパク質からシアル酸を切除するために使用できます。この用途には、多くの場合、N-グリコシダーゼF、O-グリコシダーゼ、およびノイラミニダーゼの混合物が有用です（O-グリカンの多くが有するシアリ化構造は、ノイラミニダーゼによって加水分解され、その後、O-グリコシダーゼが構造の加水分解を継続します）。酵素／基質比は、約0.04 U/25～80 µgにする必要があります。

O-グルコシダーゼとの併用
同じ条件下で（アルスロバクター属のノイラミニダーゼの代わりに）コレラ菌由来ノイラミニダーゼをO-グリコシダーゼと併用するには、O-グリコシダーゼとコレラ菌由来ノイラミニダーゼの至適pHを考慮することが重要です。したがって、pH 7.2ではなくpH 6を使用してください。

ノイラミニダーゼによるホルマリン固定細胞の処理

以下の手順は、Corral等が1990年にBBRC 172（1349-1356）に掲載した手順から抜粋したものです。

• ダルベッコPBSで3x10⁷個の細胞を洗浄します
• 等量の1%パラホルムアルデヒド、0.1 Mカコジル酸ナトリウム、pH 7.3を用いて、+4 ℃で1時間細胞を固定します
• 細胞をPBSで3回洗浄し、3x10⁷細胞/mLの濃度のPBSに再懸濁します
• この細胞懸濁液150 µLを使用し、コレラ菌由来の250 U/mLノイラミニダーゼを用いて+37 ℃で1時間処理します。

コレラ菌由来のノイラミニダーゼ（シライダーゼ）の特異的阻害剤：

• 2,3-デヒドロ-2-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸
• デヒドロ-デオキシ-N-アシル-ノイラミン酸系の高級同族体（アシル=プロピオニル...）
• ジイソプロピルフルオロホスフェート

SDS、グアニジンHCl、または尿素が酵素を阻害するかどうかは確認されていませんが、不活化は可能です。
CHAPS、Triton X100/X114、2-メルカプトエタノール、またはManidet P40が酵素を阻害することは確認されていませんが、阻害が起こらない可能性が大です。DTTによる阻害に関する情報はありません。