S7160

ApopTagフルオレセイン直接In Situアポトーシス検出キット

• UNSPSCコード: 12161503
• eCl@ss: 32161000
• NACRES: NA.84

特性

• テクニック: flow cytometry: suitable; immunocytochemistry: suitable
• 品質水準: 100
• 検出方法: fluorometric

詳細

詳細

ApopTagフルオレセイン直接In Situアポトーシス検出キットは、直接TUNEL法により、in situでアポトーシス細胞を検出します。DNA断片は、直接標識されたフルオレセインヌクレオチドでタグ付けされます。このキットでは、フローサイトメトリーを用いて分析する40サンプルの蛍光染色が行えます。

このキットは、接着細胞および懸濁細胞で使用するように設計されています。 組織切片の場合は、ApopTagキットカタログ番号S7110またはS7111を使用してください。

場合によっては、特定の組織に、ApopTagフルオレセイン直接キット（S7160）に含まれる細胞などの、あらゆるフルオレセイン標識ヌクレオチドに結合する細胞型が含まれていることがあります。したがって、このキットを用いて細胞懸濁液、サイトスピンおよび細胞培養を染色することは推奨されますが、組織切片の染色は推奨されません。Chemiconは、蛍光染色組織切片にはApopTagフルオレセインキット（S7110、S7111）またはApopTag Redキット（S7165）を使用することをお勧めしています。

そのため、ApopTag染色の結果を、形態学的基準と併せて評価することが重要です。ApopTag陽性結果を可視化すると、早期アポトーシス核とアポトーシス小体の内部の局所的なin situ染色が認められます。この陽性染色は、アポトーシスのより典型的な生化学的および形態学的側面と直接関連しています。

細胞の形態を理解することはデータ解釈にとって重要であり、正常なアポトーシス制御を実験的に修飾したり克服したりできる可能性があるため、以下の戦略が推奨されます。新しいシステムを研究する場合、アポトーシス形態とDNA断片化の段階と相関を明らかにする必要があります。一部の組織では、細胞質の収縮が、細胞を取り囲む透明な空間によって示される場合があります。陽性細胞の核形態は、高倍率（400倍～1000倍）で注意深く観察する必要があります。早期段階の陽性の円形核では、クロマチン辺縁化が観察できることがあります。中期段階の凝縮核およびアポトーシス小体は、常に染色されます。アポトーシス小体は、細胞外空間または食細胞の内部に見られることがあります。経験の浅い観察者は、新しいデータと比較するために、死につつある細胞の実例を参照することを強くお勧めします（例：11、19、24）。

ApopTag染色結果を確認するもう一つの方法はアガロースゲル上でのDNA切断の検出ですが、感度ははるかに低いです。組織内の細胞の大部分がアポトーシスを起こしている場合には、抽出した全ゲノムDNAの電気泳動と標準的な染色法を用いて、in situ染色を実証することができます。しかし、ApopTag組織染色の単一細胞感度は、この方法をはるかに上回ります。同等の感度のDNAラダーデータは、他の複数の方法でも取得できます。例えば、低分子量DNAを選択的に抽出する方法（15）、樹脂ベッドによるDNA精製（12）と組み合わせて放射性標識DNAを調製する方法（30、40）、およびPCRによるDNA増幅（35）などです。

TUNELアッセイで検出されたDNA鎖切断のin situ染色と、その後の光学顕微鏡による可視化は、アポトーシス細胞（細胞集団全体に占める割合がわずかな場合もある）に関する生物学的に重要なデータを提供します（13、16）。ApopTagキットで陽性染色されたアポトーシス細胞は、単純に組織染色した組織と比較して、検出が容易であり、より確実に同定できます。末端標識法ではアポトーシス細胞を壊死細胞より10倍以上高い感度で検出できるため、ApopTagのもう一つの特徴は、フローサイトメトリーを用いて定量的な結果が得られることです（14、17）。さらに、TUNELアッセイとフローサイトメトリーを用いて、アポトーシス細胞の細胞周期の相に関連したDNA切断の発生を調べることができます（16、18）。

よく研究されている多くのモデル系では、まず高次クロマチン構造組織のエンドヌクレアーゼ分解によって、300 kbと50 kbの大きな断片が生成されます。これらの大きなDNA断片は、パルスフィールド電気泳動ゲルで見ることができます（5、43、44）。ほとんどのモデルでは、Ca2+およびMg2+依存性エンドヌクレアーゼの活性化によってヌクレオソーム間のリンカー部位でDNAを切断することにより、これらの断片がさらに短くなります（3）。最終的なDNA断片は、約180 bpヌクレオソーム単位の多量体です。これらの多量体は、さまざまな種類のアポトーシス細胞から抽出されたDNAの標準的なアガロース電気泳動ゲルでみられる、よく知られた「DNAラダー」として現れます（例：3、7、13、35、44）。

DNA切断を介してアポトーシスを調べるもう1つの方法は、ApopTag技術の基礎となるTUNELアッセイ（13）による方法です。DNA鎖切断は、遊離3′-OH末端を修飾ヌクレオチドで酵素的に標識することによって検出されます。DNA切断によって生じたこの新しいDNA末端は、通常、形態学的に識別可能な核とアポトーシス小体に局在します。対照的に、DNAの3′-OH末端の数が比較的少ない正常核や増殖核は、通常、このキットでは染色されません。ApopTagキットは、アポトーシスに関連する一本鎖切断（25）と二本鎖切断を検出します。薬剤誘導性のDNA損傷は、それがアポトーシス応答と同時に生じない限り、TUNELアッセイでは確認されません（8）。さらにこの技術では、クロマチン凝縮が始まった、鎖切断が少ない系において、核が大幅な形態学的変化を受ける前であっても早期アポトーシスを検出することができます（4、8）。

アポトーシスは偶発的な細胞死（壊死）とは異なります。アポトーシスと壊死性細胞死を区別する多くの形態学的および生化学的差異を以下の表に要約します（参考文献39から許可を得て改変）。ApopTag In Situアポトーシス検出キットは、アポトーシスに関連するDNA切断とクロマチン凝縮を特異的に検出することで、アポトーシスと壊死とを区別します。しかし、壊死形態を示す細胞が軽度に染色される場合（14, 29）や、まれですが誘導アポトーシスにおいてDNA断片化が認められないか不完全である場合があります（11）。

アポトーシスは、損傷を受けた細胞や過剰な細胞を除去する細胞死の一形態です。外部増殖、生存、または死亡因子に対する能動応答を仲介する複数のシグナル伝達経路およびエフェクター経路によって制御されています。細胞周期チェックポイント制御はアポトーシス酵素カスケードに関連しており、がんなどの多くの疾患では、これらのカスケードやその他のリンクの完全性が遺伝的に損なわれる可能性があります。アポトーシスのあらゆる側面（例：7、11、19、24、39、42）とそれを検出する方法（例：10、32、36）については、多くの書籍が出版され、最近の総説も数百にのぼります。

アポトーシスのあらゆる側面のうち、特徴的なのは細胞形態の完全な変化です。電子顕微鏡で観察されるように、細胞では収縮、クロマチンの辺縁化、膜の水疱形成、核凝縮、その後の分節化、およびアポトーシス小体への分裂が認められ、アポトーシス小体は貪食される可能性があります（11、19、24）。この特徴的なアポトーシス小体は短命かつ微小であり、明視野顕微鏡で観察すると他の細胞成分に類似していることがあります。アポトーシス細胞のDNAが切断されると、その後細胞死が生じ、通常は数時間以内に組織から除去されます（7）。1日あたり25%という急速な組織退縮は、ある時点で細胞の2～3%にしかアポトーシスが認められないことが原因である可能性があります（6）。したがって、形態だけでアポトーシス指数を定量的に測定することは困難です。

DNAの切断は通常、アポトーシスにおける細胞形態の超微細構造的変化と関連しています（26、38）。

アプリケーション

はじめに

ApopTag In Situアポトーシス検出キットは、断片化したゲノムDNAを修飾することで、研究サンプル中のアポトーシス細胞を標識します。特異的染色によるポジティブ細胞の検出のために末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を使用します。本マニュアルには、ApopTagフルオレセイン直接In Situアポトーシス検出キット（カタログ番号：S7160）に関する情報とプロトコルが記載されています。

手順の原則

ApopTagキットで提供される試薬は、in situで、遊離3′OH DNA末端を、化学的に標識されたおよび標識されていないヌクレオチドで標識するようにデザインされています。反応バッファーに含まれるヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）によって酵素的にDNAに付加されます（13, 31）。TdTは、鋳型に依存しない、二本鎖または一本鎖DNAの3′-OH末端へのヌクレオチド三リン酸の付加を触媒します。ApopTag直接法では、組み込まれたヌクレオチドは、ランダムな配列のフルオレセインヌクレオチドと非標識ヌクレオチドからなるオリゴマーを形成します。このキットにおける標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの比は、フルオレセインの自己消光を最低限に抑えるために最適化されています。

添加したオリゴマーの正確な長さは測定していません。ApopTagフルオレセイン直接In Situアポトーシス検出キット（S7160）は、DNA断片がフルオレセインヌクレオチドで直接標識されているため、検出に抗体を使用する必要がありません。抗ジゴキシゲニン抗体を使用しないため、このシステムでは溶液の添加回数が少なくて済み（図1B）、操作が少ないので、細胞の回収率が向上します。プロトコルの所要時間も短いです。間接法と比較して平均信号強度にほとんど差はありません（32）。

ApopTagキットを使用した結果は、広く文献発表されています（Sec.V. 参考文献、ApopTagキットを引用している公表文献を参照）。ApopTag製品シリーズには、さまざまな実験計画のオプションが用意されています。明視野または蛍光顕微鏡検査法や、フローサイトメトリーによる染色の検出を、研究者が保有する専門知識と使用できる機器に応じて選択できます。また、ApopTagキットを使用すると、アポトーシスの観点から関心のあるその他のタンパク質を検討する機会が得られます。ペルオキシダーゼ以外の酵素とコンジュゲートされた抗体を使用して基質を適切に選択すれば、ApopTagペルオキシダーゼキットによって他のタンパク質とアポトーシスを同時に調べることができます。ApopTag技術では、フルオロフォア（フルオレセインとローダミン）も選択できます。他の重要なタンパク質を研究するために、抗体と蛍光体の組み合わせを柔軟に選択できます。

構成

平衡バッファー 90416 3.0 mL －15℃～－25℃ 反応バッファー 90427 2.0 mL －15℃～－25℃ TdT酵素 90418 0.64 mL －15℃～－25℃ 停止／洗浄バッファー 90419 20 mL －15℃～－25℃ プラスチックカバースリップ 90421 100 ea.室温。キットあたりの試験回数：説明書通りに使用した場合に、約5 cm2の組織検体を40回染色するために十分な資材が含まれています。スライドマウント検体にキットを使用する場合は、反応バッファーを使い果たしてから別の試薬を使用します。

保管および安定性

1.最初に使用するまでは、キットを－15℃～－25℃で保存してください。最初に使用した後、キットを3カ月以内に使用する場合は、TdT酵素（90418）は－15℃～－25℃で保存し、その他の構成要素は2℃～8℃で保存してください。2.反応バッファー中のフルオレセインヌクレオチド（90427）は、不必要な光ばく露から保護してください。使用上の注意1.以下のキット構成要素には、バッファーとしてカコジル酸カリウム（ジメチルアルシン酸）が含まれています：平衡バッファー（90416）、反応バッファー（90427）、TdT酵素（90418）。これらの構成要素は飲み込むと有害です。皮膚と眼への接触を避け（手袋、眼鏡を着用）、接触した部位はすぐに洗ってください。2. TdT酵素（90418）にはグリセロールが含まれており、－20℃では凍りません。有効期間を最長にするため、分注する前にこの試薬が室温まで温まらないようにしてください。

免責事項

メルクのカタログまたは製品に添付されたメルクのその他の文書に記載されていない場合、メルクの製品は研究用途のみを目的としているため、他のいかなる目的にも使用することはできません。このような目的としては、未承認の商業用途、in vitroの診断用途、ex vivoあるいはin vivoの治療用途、またはヒトあるいは動物へのあらゆる種類の消費あるいは適用などがありますが、これらに限定されません。

安全性情報

• ピクトグラム: GHS08,GHS07,GHS09
• シグナルワード: Danger
• 危険有害性情報: H302,H317,H319,H334,H341,H350,H360F,H373,H411
• 注意書き: P273 - P280 - P301 + P312 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338 - P308 + P313
• 危険有害性の分類: Acute Tox. 4 Oral - Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - Eye Irrit. 2 - Muta. 2 - Repr. 1B - Resp. Sens. 1 - Skin Sens. 1 - STOT RE 2 Inhalation
• ターゲットの組織: Respiratory Tract
• 保管分類コード: 6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects