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Peroxidase (POD), aktiviert

from horseradish

• Synonym(e): POD
• EC-Nummer: 1.11.1.7 (BRENDA, IUBMB)
• UNSPSC-Code: 12352204

Eigenschaften

• Biologische Quelle: horseradish
• Qualitätsniveau: 100
• Form: lyophilized
• Spezifische Aktivität: 800 units/mg protein (at 25 °C with ABTS and H₂O₂ as substrate (pH 5.0).)
• Verpackung: pkg of 8 mg (~40 mg lyophilizate)
• Hersteller/Markenname: Roche
• Optimaler pH-Wert: 6.0-6.5
• Versandbedingung: wet ice
• Lagertemp.: 2-8°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Bei Peroxidase (POD) handelt es sich um ein Enzym, das eine Gruppe spezifischer Enzyme wie NAD-Peroxidase, NADP-Peroxidase, Fettsäure-Peroxidase sowie eine Gruppe nicht spezifischer Enzyme aus verschiedenen Quellen umfasst. Das Enzym ist in Tieren, größeren Pflanzen und anderen Organismen vorhanden.

Spender: Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktase
Reagenz zur Markierung wasserlöslicher Substanzen, die primäre Aminogruppen mit Peroxidase aus Meerrettich (HRP) aufweisen.
Kapazität: ausreichend für ungefähr 6 mg IgG.

Anwendung

Das Enzym kann ohne Voraktivierung zur Markierung wasserlöslicher Substanzen mit reaktiven und zugänglichen primären Aminogruppen (z. B. Peptiden oder Proteinen) mit Peroxidase zur Verwendung bei Analyseverfahren eingesetzt werden. Es ist insbesondere für die Kopplung von Antikörpern (Ig, Ig Fab und Ig F(ab′)₂-Fragmente von Kaninchen, Maus, Schaf und Ziege) mit Peroxidase geeignet. Das daraus entstehende Konjugat ist bestens zur Verwendung in Systemen für immunchemische Nachweise geeignet, zum Beispiel ELISA, Immunhistochemie und Immun-Blotting-Verfahren.

Peroxidase (POD) wird in aktivierter Form bei der durch terminale Desoxyribonukleotidyl-Transferase (TDT)-vermittelten dUTP-Digoxigenin-Nick-Enden-Markierungsfärbung (TUNEL-Test) und in der Immunhistochemie verwendet.

Biochem./physiol. Wirkung

Peroxidase (POD) unterstützt die Dehydrierung verschiedener organischer Verbindungen wie Phenolen, aromatischen Aminen, Hydrochinonen usw.

Qualität

Isoenzyme: >90 % Isoenzym C (HPLC)
Reinheit: 3,0 – 3,5 (A₄₀₃/A₂₇₅)

Angaben zur Herstellung

Stabilisatoren: Produkt wird mit Saccharose stabilisiert.
Arbeitskonzentration: 1:4.000 bis 1:10.000
Für ELISA
Arbeitslösung: Vorbereitung von Lösungen, (15 bis 25 °C)

1. 1 M Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat-Lösung, pH 9,4
1 M Na₂CO₃: 10,6 g Na₂CO₃ in 80 ml zweifach destilliertem Wasser auflösen und bis auf 100 ml ergänzen.
1 M NaHCO₃: 8,4 g NaHCO₃ in 80 ml zweifach destilliertem Wasser auflösen und bis auf 100 ml ergänzen.
Den pH-Wert der NaHCO₃-Lösung auf 9,4 durch Hinzufügen von Na₂CO₃-Lösung abgleichen.

2. 100 mM Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat-Lösung; pH 9,8
10 ml Lösung im Verhältnis 1 zu 100 ml mit zweifach destilliertem Wasser verdünnen.

3. 200 mM Natriumborhydrid-Lösung
NB: Die Lösung unmittelbar vor ihrer Verwendung frisch zubereiten und auf Eis kühlen. 8 mg NaBH₄ in 1 ml kaltem, zweifach destilliertem Wasser auflösen.

4. 2 M Triethanolamin-Lösung, pH 8,0
2,66 ml Triethanolamin mit 3 ml zweifach destilliertem Wasser verdünnen, den pH-Wert auf 8,0 mit 25 % HCI abgleichen und mit zweifach destilliertem Wasser bis auf 10 ml ergänzen.

5. 1 M Glycin-Lösung, pH 7,0
0,75 g Glycin in ca. 6 ml zweifach destilliertem Wasser auflösen, den pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 7,0 abgleichen und mit zweifach destilliertem Wasser bis auf 10 ml ergänzen.

6. PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung); Glycin; pH 7,4.
10 mM Kaliumphosphat, 200 mM NaCI, 10 mM Glycin, pH 7,5.

• Lösung A (K₂HPO₄): 4,56 g K₂HPO₄ × 3 H₂O, 23,4 g NaCI und 1,5 g Glycin in ca. 1.500 ml zweifach destilliertem Wasser auflösen und mit zweifach destilliertem Wasser bis auf 2.000 ml ergänzen.
• Lösung B (KH₂PO₄): 2,72 g KH₂PO₄, 23,4 g NaCI und 1,5 g Glycin in ca. 1.500 ml zweifach destilliertem Wasser auflösen und mit zweifach destilliertem Wasser bis auf 2.000 ml ergänzen.
• PBS: Bei der Regulierung des pH-Wertes der Lösung A ausreichend Lösung B hinzufügen, bis der pH-Wert 7,4 erreicht wurde.

7. Antikörperlösung

0,3 ml für jede Markierungsreaktion erforderlich. Die IgG-Konzentration der zu verwendenden Lösung ist c = 4 mg/ml (3,8 – 42 mg/ml). Dieser Wert ist für die Kopplung äußerst wichtig und sollte daher fotometrisch bei jedem Test geprüft und ggf. angepasst werden: A_280 nm, 1 cm, 1 mg/ml = 1,40.
NB: Keine Konservierungsstoffe (z. B. Natriumazid) und Stabilisatoren (z. B. Albumin) verwenden.

• Immunglobulin, salzfrei, lyophilisiert:

1,6 mg in einem geeignet Behälter abwiegen und in 0,4 ml Lösung auflösen. Konzentration und pH-Wert überprüfen und ggf. korrigieren.

• Immunglobulin im Puffer:

PBS-Puffer ohne zusätzliche Proteine oder Konservierungsstoffe: den pH-Wert mit Lösung 1 auf 9,8 abgleichen und ggf. mit Lösung 2 verdünnen, um eine IgG-Konzentration von 4 mg/ml zu erzielen. Puffer mit organischen Salzen: Immunglobulin in Lösung 2 dialysieren und die Konzentration mit Lösung 2 auf 4 mg/ml abgleichen.

Stabilität der Lösungen
Lösungen 1, 2, 4, 5 und 6 sind bei 2 bis 8 °C 1 Woche lang stabil. Lösungen 3 und 7 müssen stets unmittelbar vor ihrer Verwendung frisch zubereitet werden.

Lagerbedingungen (Arbeitslösung): Die rekonstituierte Lösung ist bei 2 bis 8 °C 3 Monate lang stabil. Die Lösung kann in aliquote Teile aufgeteilt und bei -60 °C oder weniger schockgefroren und anschließend bei -15 bis -25 °C aufbewahrt werden; dies kann zu einem Aktivitätsverlust von 10 – 20 % führen.

Rekonstituierung

Durch Auflösen von Lyophilizat in 0,5 ml zweifach destilliertem Wasser wird eine Peroxidase-Konzentration von 16 mg/ml hergestellt.

Sonstige Hinweise

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS08
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H317,H334
• P-Sätze: P261 - P280 - P284 - P304 + P340 - P333 + P313 - P342 + P311
• Gefahreneinstufungen: Resp. Sens. 1 - Skin Sens. 1
• Lagerklassenschlüssel: 11 - Combustible Solids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash