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qPCR

SYBR Green-basierte qPCR

Bei der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) werden fluoreszente Reportermoleküle eingesetzt, um die Quantifizierung der amplifizierten Produkte zu ermöglichen. Wie bei der konventionellen PCR wird ein DNA-, cDNA- oder RNA-Template amplifiziert, jedoch werden in jedem Zyklus Fluoreszenzsignale zur relativen oder absoluten Quantifizierung überwacht. Diese Methode ist für zahlreiche Forschungsbereiche nützlich, wie z.B. Genexpressionsanalyse, Genotypisierung, microRNA-Analyse, genetische Variationsanalyse und Proteinanalyse.  

Analyse von qPCR-Daten

Die Fluoreszenz des Reportermoleküls wird gemessen und quantifiziert; üblicherweise handelt es sich dabei um Farbstoffe (z.B. SYBR® Green, Ethidiumbromid), die sich zwischen den Basen in doppelsträngiger DNA einlagern, oder um Sonden (z.B. Molecular Beacons, TaqMan® Sonden), die eine spezifische Sequenz auf der DNA binden.

Relative Quantifizierung von qPCR-Daten

Es gibt zwei wesentliche Quantifizierungsmethoden für qPCR-Daten. Die relative Quantifizierung ist die gebräuchlichere Methode und nutzt ΔΔCt-Informationen, anhand derer das Expressions- oder Abundanzverhältnis des Zielgens in der Probe bestimmt, mit einem Kontrollgen verglichen und mit dem Expressionsverhältnis eines Referenzgens normalisiert wird. Da die Effizienz(E)-Werte für Ziel- und Referenzgene unterschiedlich sind, berücksichtigt diese Methode auch die Unterschiede bei den E-Werten. Diese Methode wird häufiger bei der Genexpressionsanalyse eingesetzt.

Absolute Quantifizierung von qPCR-Daten

Die zweite Methode, die absolute Quantifizierung, ist in der Umweltmikrobiologie gebräuchlicher. In ihr wird die Standardkurve (SK) genutzt. Bei der SK-Methode wird anhand einer Verdünnungsreihe mit bekannter Templatekonzentration (N0) eine Standardkurve mithilfe der linearen Regression von log(N0) gegenüber dem CT-Wert (Schwellenwert) erstellt. Daraus werden dann die Templatekonzentrationen der Probe berechnet. Dieser Methode liegt zugrunde, dass der Effizienzwert der Probe und der Effizienzwert des Standards gleich sind. 

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