Risoluzione dei problemi nelle colture cellulari

La coltura di cellule si è affermata come una delle tecniche fondamentali per la modellazione dei sistemi biologici ed ha assunto crescente importanza nel settore biotecnologico e farmaceutico oltre a rappresentare un processo essenziale per i laboratori di ricerca life science. Sebbene questa tecnica sia molto accessibile, l’efficace propagazione delle cellule per l'espansione degli stock o per gli esperimenti basati su modelli cellulari può venire seriamente compromessa dalla presenza di contaminazioni o di altri fattori che influiscono negativamente sulla vitalità cellulare. La diffusa abitudine di scambiarsi le cellule ha portato a casi ben documentati di contaminazione crociata tra stock di cellule la cui identità era in precedenza certa. Identificare i motivi, frequenti o rari, per i quali le cellule faticano a crescere può aumentare l'efficienza del laboratorio, migliorare la resa dei prodotti ottenuti dalle colture cellulari e garantire la significatività e l’affidabilità dei dati ottenuti dai modelli in vitro.

Errata identificazione delle linee cellulari

Studi recenti stimano che un'identificazione errata può riguardare fino a un terzo di tutte le linee cellulari in uso. Queste studi possono potenzialmente mettere in discussione i risultati pubblicati sui sistemi biologici basati sull’uso di linee cellulari come sistema modello. I fattori che portano all'errata identificazione/contaminazione crociata delle linee cellulari includono:

• contaminazione con linee cellulari aggressive: l'analisi degli isoenzimi ha dimostrato che molte linee cellulari condividono una rara isoforma enzimatica con le cellule HeLa. Da allora è stato dimostrato che la linea HeLa è la linea contaminante più comune negli stock di coltura
• documentazione e procedure di etichettatura: le fiasche per colture cellulari, piastre, contenitori criogenici e freezer devono essere chiaramente etichettati e gli schemi di conservazione in azoto liquido devono essere rigorosamente aggiornati per tracciare l'aggiunta, il prelievo e il trasferimento degli stock cellulari
• prestito della linea cellulare: la condivisione delle cellule tra laboratori vicini è una pratica comune che può portare ad errori nell'identità delle linee cellulari. Le linee cellulari dovrebbero essere ottenute solo da banche di cellule attendibili quali l’European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) di Public Health England.

Panoramica sulle principali fonti di contaminazione crociata delle linee cellulari e su come proteggere il lavoro dalle conseguenze della contaminazione.

Contaminazione microbica delle colture cellulari

I terreni per le colture cellulari e le condizioni di incubazione forniscono l'ambiente ideale per le cellule ma anche per contaminanti batterici, fungini e virali. Per aumentare la conformità alla tecnica di coltura asettica, le colture devono essere regolarmente esaminate al microscopio per valutare la presenza di intrusi batterici e fungini. Alcuni contaminanti microbici ubiquitari sfuggono al rilevamento visivo, visto che si stima che fino al 30% di tutte le colture sia contaminato da micoplasma. I reagenti e i kit progettati per il rilevamento di micoplasmi non visibili sono spesso basati sull'amplificazione mediante PCR, che può essere utilizzata anche per rilevare contaminanti virali.

Scopri come mantenere le colture libere da contaminanti biologici e chimici.

Scarsa crescita cellulare

È frustrante quando le cellule in coltura che sembrano sane non riescono a raggiungere la confluenza Una volta esclusa la presenza di contaminazioni, i possibili fattori che potrebbero limitare la duplicazione delle cellule sane sono:

• condizioni e qualità dei terreni di coltura/congelamento
• qualità e idoneità dei supplementi per l'applicazione di interesse
• conta imprecisa delle celle durante il congelamento o i passaggi in coltura

Scopri come migliorare le condizioni di coltura per una crescita ottimale prima di un nuovo scongelo.

Distacco di cellule con fenotipo aderente

Le cellule aderenti in coltura possono staccarsi spontaneamente, singolarmente o in strati. Se le culture aderenti non rimangono tali scopri come controllare e ripristinare l’adesione in coltura

Formazione di aggregati di cellule

Le cellule in sospensione imitano le condizioni in vivo come singoletti. Se le cellule cominciano ad aggregarsi è possibile che ciò sia dovuto alla presenza di acidi nucleici appiccicosi, il che si verifica quando la coltura è sottoposta a condizioni di stress. Cosa nel terreno può causare l'aggregazione delle cellule? Leggi qui per capire come eliminare l'aggregazione delle cellule.

Morte delle cellule nelle colture cellulari

In caso di morte delle cellule in coltura, la prima cosa da escludere è la presenza di contaminazioni da parte di microrganismi. Altri fattori che possono inficiare la salute delle cellule o portare a comportamenti incoerenti con il fenotipo includono:

• condizioni dello dello stock congelato
• numero di passaggi in coltura/sovraconfluenza
• condizioni di stress ambientale
• eccessivo trattamento con enzimi di dissociazione

Attrezzature appropriate, reagenti qualificati e l’esperienza nell’uso dei protocolli sono fondamentali per affrontare i risultati imprevisti che talvolta si osservano nella coltura delle cellule.

Presenza di precipitati nelle colture cellulari

Se non è dovuto alla presenza di contaminazioni, il particolato in coltura ha spesso una origine inorganica. Scopri di più sui tamponi bilanciati, sui componenti dei terreni e su come mantenere in sospensione i componenti dei terreni.