Crescita e mantenimento di colture cellulari
La coltura delle cellule è una tecnica fondamentale nelle ricerche life science per allestire modelli biologici di rilievo o per produrre proteinericombinanti, particelle virali o terapie biologiche. La crescita e il mantenimento in coltura delle cellule batteriche, di lievito e di mammifero avviene in una cabina di biosicurezza (chiamata anche “cappa” per colture cellulari o tissutali) utilizzando una tecnica asettica appropriata per prevenire contaminazioni microbiche e chimiche.
Tipi di colture cellulari
Due tra le strategie più importanti per la coltura di cellule di mammifero sono la coltura primaria e la coltura continua. Le colture primarie derivano direttamente da tessuti umani o animali e hanno una durata di vita limitata dalla senescenza cellulare. Le colture continue sono considerate "immortali", poiché spesso derivano da tessuti tumorali di paziente. Le linee cellulari possono essere generate anche immortalizzando le cellule e possono essere propagate o suddivise (tramite i cosiddetti passaggi) in maniera seriale per molti cicli di divisione cellulare o indefinitamente.
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Le cellule possono essere coltivate in sospensione o come un monostrato 2D che si attacca alla fiasca da coltura tissutale o alla piastra multipozzetto. Il metodo di coltura usato dipende dal tessuto di origine delle cellule; le cellule derivate dal sangue crescono generalmente in sospensione, mentre quelle derivate dai tessuti solidi crescono tipicamente in monostrato.
In generale si ritiene che le colture cellulari 3D (organoidi e sferoidi) riproducano più verosimilmente l'ambiente in vivo della cellula rispetto alle cellule cresciute su superfici 2D. Gli sferoidi sono spesso ottenuti a partire da linee cellulari cancerose o da biopsie tumorali (xenotrapianti derivati da paziente, o PDX) sotto forma di aggregati cellulari liberamente fluttuanti in piastre ad adesione ultra-bassa, mentre gli organoidi sono tipicamente ottenuti a partire da cellule staminali tissutali incorporate all'interno di un idrogel derivato dalla matrice extracellulare (ECM) e quindi indotte a differenziarsi.
Fasi della crescita cellulare
Garantire un'adeguata crescita cellulare è fondamentale per raccogliere dati accurati negli studi basati sulle colture cellulari. Il numero delle cellule può essere calcolato utilizzando un emocitometro oppure un contatore di cellule automatico, che offre conte cellulari più precise.
La crescita cellulare in coltura avviene generalmente in quattro fasi:
- fase di latenza (lag) – le cellule si stanno adattando alle condizioni di coltura e non si dividono.
- fase di crescita logaritmica (log) – le cellule si dividono attivamente, è la fase più adatta per valutare la crescita della popolazione cellulare o per raccogliere dati. La fase logaritmica tardiva rappresenta il momento migliore per suddividere (sottocoltura) le cellule.
- fase di plateau (stazionaria) – quando le cellule si avvicinano al 100% di confluenza la crescita rallenta e, man mano che si accumulano i cataboliti cellulari e le risorse si esauriscono, diventano più suscettibili allo stress o a danni.
- fase di declino – si assiste a una riduzione della popolazione di cellule vive in quanto predomina la morte cellulare.
Terreni per colture cellulari, supplementi e reagenti
Le cellule in coltura richiedono un adeguato apporto di nutrienti per poter crescere. I terreni per la coltura di cellule di mammifero devono mantenere il pH fisiologico, oltre ad apportare sali, carboidrati, aminoacidi, vitamine, acidi grassi e lipidi, proteine e peptidi, oligoelementi e fattori di crescita bilanciati. Il siero fetale bovino (FBS) è il supplemento di crescita più utilizzato per la coltura delle cellule di mammifero in quanto contiene molti di questi nutrienti essenziali e ne è stato dimostrato il supporto alla crescita di cellule e tessuti in coltura. Per le applicazioni che richiedono terreni definiti o a ridotto contenuto di componenti di origine animale sono disponibili terreni a formulazione xeno-free, a composizione nota e privi di componenti animali.
Poiché spesso i terreni e i supplementi rappresentano anche un fertile nutrimento per la crescita di microbi opportunisti, le colture cellulari richiedono una tecnica asettica e l'osservazione regolare per garantire l'assenza di contaminanti che potrebbero causarne la morte o alterarne la crescita simil-in vivo. Per quanto riguarda i comuni contaminanti microbici non osservabili al microscopio, il ricorso a screening di routine con reagenti per la rilevazione del micoplasma protegge gli ambienti di propagazione delle colture e dei tessuti.
Le colture di lievito, come quelle di S. cerevisiae e P. pastoris (Pichia), si usano comunemente per gli studi sull'espressione di proteine ricombinanti e sulla funzione genica. I nutrienti fondamentali tipicamente inclusi nella formulazione del terreno di coltura per il lievito sono peptone, estratto di lievito e destrosio o glucosio.
Consigli e suggerimenti pratici per la suddivisione delle cellule (passaging)
Per mantenere in salute e ottimizzare la crescita cellulare, la suddivisione delle cellule in sottocolture è prassi fondamentale. Questo tutorial spiega la procedura per suddividere le cellule e l'importanza di fattori come la confluenza e la densità cellulare. Il protocollo per la suddivisione delle cellule prevede procedure quali il monitoraggio e il conteggio delle cellule, la loro tripsinizzazione o dissociazione e la loro risemina in nuovi supporti per colture.
Ambienti e materiali per colture cellulari
Le cellule in coltura vengono coltivate e manipolate utilizzando materiali in plastica sterile monouso, come fiasche, piastre multipozzetto, pipette sierologiche, unità filtranti sterili da bottiglia e filtri sterili da siringa. Le fiasche e le piastre in materiale plastico usate per la coltura di tessuti sono generalmente trattate in modo da fornire una superficie idrofila che faciliti l'adesione delle cellule aderenti. In alternativa alle classiche superfici 2D, le piastre a membrana microporosa forniscono un ambiente di crescita più fisiologico per le analisi cellulari complesse, come la migrazione cellulare, la comunicazione tra cellule e la polarizzazione cellulare.
La temperatura e l'ambiente gassoso in cui vanno mantenute le cellule in coltura devono ricreare le condizioni presenti nell'organismo da cui derivano. I supporti contenenti cellule e terreni sono quindi solitamente mantenuti all'interno di incubatori dotati di un controllo preciso della temperatura e delle miscele di gas. Tuttavia, i sistemi di incubazione da banco su piccola scala che impiegano la microfluidica e facilitano l'imaging delle cellule in una coltura ininterrotta presentano le condizioni ambientali più autentiche per i modelli predittivi in vitro.
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