Przygotowanie i barwienie tkanek i rusztowań drukowanych w 3D

Wprowadzenie

Trójwymiarowe (3D) drukowanie tkanek biologicznych szybko staje się integralną częścią inżynierii tkankowej. Wraz z postępem w technologii druku 3D, możliwe są obecnie liczne nowatorskie metody wytwarzania, pozwalające na produkcję konstrukcji wypełnionych komórkami,^1-2 tkanek kompozytowych² jak również tkanek bez rusztowań³. Postępy te przybliżają nas o krok do drukowania całych funkcjonalnych narządów z surowców. Druk 3D może być również wykorzystywany do tworzenia rusztowań inżynierii tkankowej, które naśladują trójwymiarowe mikrośrodowisko natywnego narządu. Do wytwarzania rusztowań tkankowych druk 3D nadaje się do szerokiej gamy biomateriałów, takich jak fosforan wapnia, ⁴ CaSiO₃,⁵ kolagen,⁴ hydrożel,⁶ hydroksyapatyt,^7-8 polikaprolakton (PCL),^2,8 jak również polimery na bazie skrobi.⁹ Ta elastyczność pozwala na wytwarzanie struktur kompozytowych, które najlepiej naśladują warunki fizjologiczne otaczające tkankę, w tym wskazówki topograficzne, a także właściwości mechaniczne.¹⁰ Dzięki tym właściwościom, rusztowania drukowane w 3D służą jako pożądane struktury podporowe do hodowli 3D komórek.

Z drugiej strony, charakterystyka tkanek drukowanych w 3D często wymaga etapów przygotowawczych, które nie są stosowane w konwencjonalnej analizie hodowli tkanek 2D. Na przykład, obrazowanie przez grubą tkankę 3D przy użyciu technik mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia konfokalna, jest trudne ze względu na rozproszone światło w próbkach biologicznych. Z tego powodu wiele podejść do obrazowania stosuje się do skrawków tkanek o grubości mniejszej niż 20 µm.¹¹ Podczas gdy innowacyjne podejścia do obrazowania zgłaszają udaną wizualizację znacznie grubszych tkanek, nadal są one ograniczone do tkanek o grubości co najwyżej kilku milimetrów.¹¹ Dlatego prawidłowe sekcjonowanie jest ważne dla charakterystyki wielowarstwowych konstrukcji komórkowych wytwarzanych przez drukowanie 3D. Barwniki biologiczne powinny być starannie dobrane w celu uzyskania najbardziej istotnych informacji o wydrukowanej tkance, takich jak żywotność i dojrzewanie komórek. Na przykład, określenie żywotności komórek w wewnętrznym rdzeniu konstrukcji wydrukowanej w 3D jest ważne, ponieważ komórki te mogą mieć większą szansę na martwicę z powodu niewystarczającej wymiany składników odżywczych.¹² W tym centrum technologicznym krótko omawiamy metody przetwarzania i barwienia w celu oceny tkanek i rusztowań wydrukowanych w 3D.

Potwierdzenie kompatybilności materiału z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania

Przed optymalizacją techniki druku 3D dla konkretnego zastosowania biologicznego, korzystne może być potwierdzenie kompatybilności materiału z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania, aby upewnić się, że komórki przyłączają się i proliferują na wydrukowanym materiale. W tym celu można przeprowadzić testy żywotności i proliferacji komórek hodowanych na surowcu.

Przygotowanie wydrukowanej w 3D tkanki/rusztowania do mikroskopii świetlnej

Po pomyślnym wydrukowaniu lub wyhodowaniu konstruktu komórkowego na rusztowaniu, przed osadzeniem i sekcjonowaniem stosuje się utrwalacz chemiczny (Tabela 1), aby zapobiec zmianie lub utracie składników komórkowych podczas przetwarzania. Alternatywnie, tkanka może zostać zamrożona i poddana kriosekcji, jeśli utrwalanie chemiczne nie jest pożądane. Podczas gdy użycie roztworu formaliny jest popularne w utrwalaniu tkanek,¹³ wybór utrwalacza zależy w dużej mierze od specyficznych właściwości tkanki i celu badania. Czynniki, które mogą wpływać na utrwalanie obejmują mechanizm utrwalacza (np. sieciowanie, denaturacja itp.) ¹³ jak również warunki procedury utrwalania (np. temperatura i czas ekspozycji tkanki na utrwalacz).^13-14 Do utrwalania tkanek dostępne są również nietoksyczne środki, które nie zawierają formaldehydu ani aldehydu glutarowego (HistoChoice^® utrwalacz tkankowy  (Nr produktu. H2904) oraz  środek czyszczący  (Nr produktu. H2779). Pełną listę produktów do przetwarzania tkanek można znaleźć tutaj.

Tabela 1. Różne utrwalacze stosowane do utrwalania tkanek.

Po prawidłowym utrwaleniu, tkanka może być kolejno odwodniona w etanolu  (Nr produktu. E7023) i zatopić w podłożu takim jak Paraplast^®  (Tabela 2) do sekcji.¹³ Zatopiona tkanka może zostać podzielona na sekcje o pożądanej grubości na szklanych szkiełkach (Tabela 2) przy użyciu mikrotomu. Grubość przekroju powinna być określona w oparciu o konkretny typ wydrukowanej tkanki, a także barwniki biologiczne, które zostaną użyte. Na przykład, podczas gdy tkanki mięśniowe mogą być cięte w plasterkach o grubości 4-6 µm, próbki mózgu lub rdzenia kręgowego zaleca się ciąć w grubszych (10-40 µm) plasterkach.¹⁵

Tabela 2. Materiały używane do przetwarzania i osadzania próbek tkanek.

Po wycięciu tkanki na szkiełka mikroskopowe można wykonać różne procedury barwienia przy użyciu barwników i buforów wymienionych w Tabeli 3. W przypadku konkretnego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania można zastosować techniki immunohistochemiczne (IHC). Aby uzyskać więcej informacji na temat IHC, kliknij ten link. Po IHC próbki są często wybarwiane z użyciem przeciwbarwnika, takiego jak DAPI (Nr produktu. D9542) lub  hematoksylina (Nr produktu. HHS16).

Tabela 3. Popularne barwniki i bufory biologiczne

Imaging 3D printed tissue/scaffold using scanning electron microscopy (SEM)

In addition to light microscopy techniques described above, SEM analysis may be necessary to visualize nanoscale morphology of the 3D printed construct. Obrazowanie SEM jest szczególnie przydatne w przypadku rusztowań drukowanych w 3D, które są zaprojektowane tak, aby naśladować mikro/nanostruktury mikrośrodowiska tkankowego. Przygotowanie próbek biologicznych do SEM obejmuje utrwalenie w utrwalaczach klasy EM (Tabela 4), sekwencyjne odwodnienie w etanolu (Nr produktu. E7023), suszenie w punkcie krytycznym i powlekanie materiałem przewodzącym (np. złotem) w celu zmniejszenia artefaktów ładowania.

Tabela 4. Środki chemiczne stosowane do utrwalania i odwadniania w celu przygotowania obrazów SEM

Referencje

1. Kolesky DB, Truby RL, Gladman AS, Busbee TA, Homan KA, Lewis JA. 2014. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater.. 26(19):3124-3130. https://doi.org/10.1002/adma.201305506

2. Lee J, Hong JM, Jung JW, Shim J, Oh J, Cho D. 3D printing of composite tissue with complex shape applied to ear regeneration. Biofabrication. 6(2):024103. https://doi.org/10.1088/1758-5082/6/2/024103

3. Norotte C, Marga FS, Niklason LE, Forgacs G. 2009. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30(30):5910-5917. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.06.034

4. Inzana JA, Olvera D, Fuller SM, Kelly JP, Graeve OA, Schwarz EM, Kates SL, Awad HA. 2014. 3D printing of composite calcium phosphate and collagen scaffolds for bone regeneration. Biomaterials. 35(13):4026-4034. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.01.064

5. Wu C, Fan W, Zhou Y, Luo Y, Gelinsky M, Chang J, Xiao Y. 2012. 3D-printing of highly uniform CaSiO3 ceramic scaffolds: preparation, characterization and in vivo osteogenesis. J. Mater. Chem.. 22(24):12288. https://doi.org/10.1039/c2jm30566f

6. Hockaday LA, Kang KH, Colangelo NW, Cheung PYC, Duan B, Malone E, Wu J, Girardi LN, Bonassar LJ, Lipson H, et al. 2012. Rapid 3D printing of anatomically accurate and mechanically heterogeneous aortic valve hydrogel scaffolds. Biofabrication. 4(3):035005. https://doi.org/10.1088/1758-5082/4/3/035005

7. Leukers B, Gülkan H, Irsen SH, Milz S, Tille C, Schieker M, Seitz H. 2005. Hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering made by 3D printing. J Mater Sci: Mater Med. 16(12):1121-1124. https://doi.org/10.1007/s10856-005-4716-5

8. Park SA, Lee SH, Kim WD. 2011. Fabrication of porous polycaprolactone/hydroxyapatite (PCL/HA) blend scaffolds using a 3D plotting system for bone tissue engineering. Bioprocess Biosyst Eng. 34(4):505-513. https://doi.org/10.1007/s00449-010-0499-2

9. Lam C, Mo X, Teoh S, Hutmacher D. 2002. Scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer. Materials Science and Engineering: C. 20(1-2):49-56. https://doi.org/10.1016/s0928-4931(02)00012-7

10. Murphy SV, Atala A. 2014. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32(8):773-785. https://doi.org/10.1038/nbt.2958

11. Gantenbein-Ritter B, Sprecher CM, Chan S, Illien-Jünger S, Grad S. 2011. Confocal Imaging Protocols for Live/Dead Staining in Three-Dimensional Carriers.127-140. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_14

12. Griffith CK, Miller C, Sainson RC, Calvert JW, Jeon NL, Hughes CC, George SC. 2005. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11(1-2):257-266. https://doi.org/10.1089/ten.2005.11.257

13. Howat WJ, Wilson BA. 2014. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70(1):12-19. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2014.01.022

14. Zeller R. 1989. Fixation, Embedding, and Sectioning of Tissues, Embryos, and Single Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 7(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb0101s07

15. Chen X, Cho D, Yang P. 2010. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci.. 2(5):241–245. https://dx.doi.org/10.4297%2Fnajms.2010.2241