Badanie MSI i IHC

Mike Lacey, M.D.

Medical Director

Testowanie MSI
Historia
Niedobór naprawy niedopasowania
Znaczenie prognostyczne niedoboru Mismatch Repair
w raku jelita grubego
Poradnictwo genetyczne i postępowanie w
dziedzicznym raku jelita grubego niezwiązanym z polipowatością
Rokowanie

Testy MSI

Rak jelita grubego jest powszechnym zjawiskiem wśród mieszkańców większości krajów zachodnich, ustępując jedynie rakowi płuc.¹ Pomimo poprawy technik chirurgicznych i schematów chemioterapii, rokowanie w tej chorobie nie poprawiło się znacząco w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Obawy te nakazują zwrócenie większej uwagi na etiologię i patogenezę raka jelita grubego.

Chociaż czynniki dietetyczne zostały dobrze zbadane w badaniach etiologicznych2, najbardziej przewidywalny czynnik ryzyka choroby, jej dziedziczna predyspozycja, otrzymał ograniczoną uwagę. Może to wynikać z niedostatecznej wiedzy klinicystów na temat roli czynników genetycznych w etiologii raka.³ Na przykład wielu lekarzy uważa, że rodzinna polipowatość gruczolakowata (FAP) jest jedynym genetycznym czynnikiem ryzyka związanym z etiologią raka jelita grubego. Jednak FAP stanowi około 1% całkowitego obciążenia rakiem jelita grubego, podczas gdy dziedziczne zespoły raka jelita grubego są co najmniej sześć do ośmiu razy częstsze niż FAP.^3,4

Hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (HNPCC), lub zespół Lyncha, jest autosomalnym dominującym zespołem stanowiącym od 5 do 10% całkowitego obciążenia rakiem jelita grubego.⁵ Brak charakterystycznych cech diagnostycznych skłonił do wprowadzenia pewnych kryteriów w celu ustalenia tej diagnozy: (a) histologicznie zweryfikowany rak jelita grubego u co najmniej trzech krewnych (z których jeden jest krewnym pierwszego stopnia pozostałych dwóch), (b) obecność choroby w co najmniej dwóch kolejnych pokoleniach oraz (c) jeden lub więcej przypadków raka jelita grubego zdiagnozowanych przed 50 rokiem życia. Kryteria te, znane jako "Kryteria Amsterdamskie I", zostały zaproponowane w celu identyfikacji rodzin HNPCC z dziedzicznym rakiem jelita grubego.^5-7

Typowe cechy HNPCC obejmują rodzinną historię raka jelita grubego (CRC) w stosunkowo młodym wieku, przewagę guzów proksymalnych i tendencję do występowania wielu guzów pierwotnych, synchronicznych lub metachronicznych. Niektóre rodzaje guzów pozakolonowych są również związane z chorobą, takie jak guzy endometrium, jajnika, żołądka, jelita cienkiego, dróg wątrobowo-żółciowych, trzustki, mózgu i dróg moczowych.^6,8-10

Rysunek 1. PMS2 (EPR3947†) - gruczolakorak okrężnicy. Zwróć uwagę na znakowanie jądrowe komórek gruczolakoraka, normalnych komórek krypt i limfocytów w blaszce właściwej.

Historia

Henry T. Lynch natknął się na chorobę, która ostatecznie nosiła jego imię, konsultując się z pacjentem z silną historią CRC przy braku jawnej polipowatości.^29,30 Analiza rodowodowa rodziny tego pacjenta stanowiła podstawę "Czynników dziedzicznych w raku" Lyncha z 1966 roku. Study of 2 large midwestern kindreds", opublikowanej w Arch Intern Med.¹⁷ Aktualizacja rodziny Lynch i Krush, opublikowana w 1971 r., zawiera dane dotyczące ponad 650 członków rodziny. Odnotowano wiele istotnych cech zespołu: (1) zwiększoną częstość występowania gruczolakoraków, głównie jelita grubego i endometrium; (2) zwiększone ryzyko wystąpienia wielu nowotworów; (3) dziedziczenie autosomalne dominujące; oraz (4) wczesny początek raka.¹⁰ Pomimo wnikliwości Lyncha i Krusha, ich poglądy spotkały się ze znacznym sceptycyzmem ze strony całej społeczności naukowej, ponieważ współczesne myślenie było zdominowane przez pogląd, że czynniki środowiskowe były głównym determinantem raka.^29,30

Rysunek 2. Zalecenia dotyczące genetycznych badań przesiewowych w kierunku dziedzicznego raka jelita grubego niezwiązanego z polipowatością (HNPCC).

Pomysły Lyncha powoli zyskiwały na popularności, szczególnie w społeczności międzynarodowej, czego kulminacją było zorganizowanie "International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer" złożonej z "30 wiodących ekspertów z 8 różnych krajów". Grupa spotkała się w Amsterdamie latem 1990 roku. Głównym wynikiem tego spotkania było sformułowanie szeregu kryteriów klinicznych (obecnie znanych jako kryteria amsterdamskie i potocznie nazywanych zasadą "3-2-1"), które miały służyć jako wspólny punkt wyjścia dla przyszłych badań: (1) co najmniej 3 krewnych z histologicznie potwierdzonym rakiem jelita grubego, z których 1 jest krewnym pierwszego stopnia pozostałych 2; rodzinna polipowatość gruczolakowata powinna być wykluczona; (2) co najmniej 2 kolejne pokolenia zaangażowane; oraz (3) co najmniej 1 z nowotworów zdiagnozowanych przed 50 rokiem życia.¹⁹ Kryteria amsterdamskie (AC) zostały zaktualizowane na spotkaniu grupy w 1998 r., uznając znaczenie podzbioru nowotworów pozakomórkowych (tj. endometrium, jelita cienkiego, moczowodu i miedniczki nerkowej). Te zmienione AC-II są przedstawione w Tabeli 1.

Kryteria Amsterdamskie II: Kryteria kliniczne dla rodzin z HNPCC* (Tabela 1)

• ≥3 krewnych z nowotworem związanym z HNPCC**<
• ≥2 kolejne pokolenia dotknięte chorobą
• ≥1 zdiagnozowany przed 50. rokiem życia<
• 1 powinien być krewnym pierwszego stopnia pozostałych 2
• Rodzinna polipowatość gruczolakowata powinna być wykluczona
• Guz powinien być zweryfikowany przez badanie patologiczne

Gastroenterology. 1999;116:1453-1456.2

*Wszystkie kryteria muszą być spełnione.

**Rak jelita grubego, rak endometrium, jelita cienkiego, moczowodu lub miedniczek nerkowych. HNPCC oznacza dziedzicznego raka jelita grubego bez polipowatości.

Molekularne podstawy genetyczne zespołu Lyncha zostały w dużej mierze wyjaśnione w szybkiej serii raportów z lat 1993-1994. Peltomaki i współpracownicy powiązali chorobę (w 2 dużych rasach spełniających pierwotne AC) z locus na chromosomie 2p. Następnie 3 grupy niezależnie zgłosiły osobliwy fenotyp molekularny w CRC charakteryzujący się powszechnymi zmianami długości sekwencji prostych sekwencji powtarzalnych, zjawisko, które grupy różnie nazywały "błędami replikacyjnymi (RER)", "MSI" i "wszechobecnymi mutacjami somatycznymi w prostych sekwencjach powtarzalnych". Aaltonen i wsp.³¹ znaleźli fenotyp RER-dodatni w 11/14 (79%) "guzach dziedzicznego raka jelita grubego bez polipowatości (HNPCC)" i 6/46 (13%) sporadycznych CRC. Sporadyczne guzy RER+ charakteryzowały się przewagą prawostronną i prawie diploidalnym statusem z przypadkami HNPCC. Thibodeau i wsp.³² stwierdzili pewien stopień MSI w 25/90 (28%) CRC, łącząc to zjawisko z proksymalną lokalizacją i poprawą przeżycia oraz wykazując odwrotny związek z utratą heterozygotyczności. Grupa Ionova zgłosiła wszechobecne mutacje somatyczne w prostych sekwencjach powtarzalnych w 12% CRC, które były stosunkowo częstsze u kobiet i były związane z prawostronną lokalizacją, słabo zróżnicowaną histologią, mniejszą liczbą mutacji KRAS i p53 oraz niższym stadium zaawansowania nowotworu.¹⁴² Do końca 1993 r. sklonowano odpowiedni gen na 2p, MSH2, i zidentyfikowano mutacje linii zarodkowej w rodzinach Lynch.^33,34 Drugi locus choroby został powiązany z 3p, a na początku 1994 r. odnotowano mutacje zarodkowe MLH1 w rodzinach Lynch.^35-37 Następnie wykazano mutacje powodujące chorobę w PMS2 i MSH6.^38-40 W ciągu następnych 15 lat wiedza ta została wykorzystana do lepszego zrozumienia częstości występowania choroby i jej fenotypu oraz do zbadania kwestii klinicznych związanych z wykrywaniem i leczeniem. Szczególnie godne uwagi w tym okresie są 2 warsztaty sponsorowane przez National Cancer Institute (NCI) poświęcone wydaniu wytycznych ("wytyczne Bethesda") w celu identyfikacji pacjentów, którzy odnieśliby korzyści z badań klinicznych w kierunku zespołu Lyncha.^11,12 Zmienione wytyczne Bethesda (BG) przedstawiono w Tabeli 2.

Naprawa błędów

.Replikacja DNA wiąże się ze skończoną liczbą błędów, w tym z włączeniem błędnie sparowanych zasad (np. G z A) i poślizgiem nici DNA podczas replikacji (co skutkuje tworzeniem pętli insercji/delecji). Niepowodzenie w naprawie tych błędów skutkuje odpowiednio mutacjami punktowymi i przesunięciami ramki. Aparat MMR DNA rozpoznaje błędy, które wymykają się funkcji korekty polimerazy DNA. System ten jest wysoce konserwatywny od bakterii do ludzi, a ponieważ system ten został wcześniej scharakteryzowany w organizmach jednokomórkowych, związek między niestabilnością mikrosatelitarną (MSI) a wadliwą funkcją naprawy niedopasowania (dMMR) w ludzkim raku został po raz pierwszy rozpoznany przez genetyków drobnoustrojów.^42,43 Ludzkie geny MMR zostały nazwane na cześć ich prokariotycznych odpowiedników. Na przykład, MSH2 to "MutS homologue 2" ("mut" odnosi się do uogólnionej hipermutowalności odnotowanej w szczepach bakteryjnych z utratą funkcji MutS). Białka MMR funkcjonują jako heterodimery. Kompleks MSH2-MSH6 rozpoznaje nieprawidłowo sparowane zasady i pętle insercyjne/delecyjne. Rekrutuje MLH1-PMS2, który następnie kieruje pozostałą częścią maszynerii MMR.⁴³ MSH2 i MLH1 są dominującymi (obowiązkowymi) składnikami swoich par. W przypadku braku MSH6, MSH2 może łączyć się w pary z MSH3, a w przypadku braku PMS2, MLH1 może łączyć się w pary z PMS1.

Revised Bethesda Guidelines: Badanie kliniczne guzów jelita grubego pod kątem MSI* (Tabela 2)

• Rak jelita grubego zdiagnozowany u pacjenta w wieku 50 lat
• obecność synchronicznego lub metachronicznego CRC lub innych nowotworów związanych z HNPCC, niezależnie od wieku**
• CRC o histologii MSI-H zdiagnozowany u pacjenta <60 lat***
• CRC zdiagnozowany u krewnych pierwszego stopnia Z1 z nowotworem związanym z HNPCC, przy czym jeden z nowotworów został zdiagnozowany w wieku <50 lat
• CRC zdiagnozowany u krewnych pierwszego lub drugiego stopnia Z2 z nowotworami związanymi z HNPCC, niezależnie od wieku

J Natl Cancer Inst. 2004;96:261-268.3

* Spełnienie tylko 1 kryterium niezbędnego do przeprowadzenia badań klinicznych.

** Nowotwory związane z HNPCC zdefiniowane tutaj jako nowotwory jelita grubego, endometrium, żołądka, jajnika, trzustki, moczowodu i miedniczek nerkowych, dróg żółciowych, mózgu (glejak), skóry (gruczolak łojowy i rogowiak) i jelita cienkiego.

***Limfocyty naciekające guz, reakcja podobna do reakcji Crohna, różnicowanie śluzowate/pierścienia pręcikowego lub wzorzec wzrostu rdzeniastego. CRC oznacza raka jelita grubego; HNPCC, dziedziczny rak jelita grubego bez polipowatości; MSI, niestabilność mikrosatelitarna.

Rysunek 3. MLH1 (G168-728) w gruczolaku okrężnicy u 55-letniego mężczyzny; znakowanie jądrowe komórek gruczolaka.

Białka MSH6 i PMS2 są niestabilne pod nieobecność ich dominującego partnera. Zostało to wykazane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji-polimerazy i Western blot w serii linii komórkowych dMMR.⁵⁰ Ponadto większość mutacji Lynch to mutacje nonsensowne lub przesunięcia ramki, prowadzące do skróconych (niestabilnych) białek; mutacje missensowne mogą destabilizować powstałe mRNA lub białko lub zakłócać interakcję białko-białko.⁵¹ Te cechy białek MMR mają kliniczne konsekwencje diagnostyczne w odniesieniu do interpretacji immunohistochemii MMR (IHC) ("Badanie kliniczne").

Niestabilność mikrosatelitarna

Mikrosatelity to proste powtarzalne sekwencje DNA rozproszone w całym genomie, składające się z 1 do 6 par zasad, które mogą powtarzać się do 100 razy. Są one z natury hipermutowalne ze względu na ich skłonność do poślizgu nici podczas replikacji DNA. Korekta powstałych pętli insercji/delecji wymaga nienaruszonej funkcji systemu MMR DNA. W przypadku utraty funkcji MMR pętle insercji/delecji nie są naprawiane, co powoduje zmienną ekspansję lub kurczenie się mikrosatelitów. Zjawisko to jest określane jako MSI (wykazane w testach MSI jako typowy wzór prążków na żelu lub pików na analizatorze sekwencji). Geny zawierające proste powtarzające się sekwencje w krytycznych regionach są podatne na to samo zjawisko. Powstałe mutacje z przesunięciem ramki w guzach MSI-H prowadzą do utraty funkcji w dobrze opisanej grupie supresorów nowotworów, w tym TGFbRII, BAX, IGFRII i, co ciekawe, MSH3 i MSH6.^52-55 Jako takie, guzy MSI-H zostały opisane jako wykazujące "fenotyp mutatora".

Warsztaty NCI z 1997 roku ustanowiły referencyjny panel mikrosatelitów do badań klinicznych i badawczych oraz zdefiniowały kryteria diagnostyczne dla fenotypów MSI-H, MSI-L i MSS. Podstawowy panel składa się z 2 powtórzeń mononukleotydowych (BAT25, BAT26) i 3 powtórzeń dinukleotydowych (D5S346, D2S123, D17S250). Dostępnych jest również 19 "alternatywnych loci". Analizując 5 loci, MSI-H definiuje się jako niestabilność w 2 loci, a MSI-L jako niestabilność w 1 loci. Biorąc pod uwagę niepewność co do zdolności skończonego panelu do ostatecznego odróżnienia MSI-L od MSS, guzy wykazujące niestabilność w 0 loci są definiowane jako "MSS lub MSI-L". Gdy badanych jest więcej niż 5 loci, MSI-H definiuje się jako niestabilność w >30% do 40% badanych loci, a MSI-L jako niestabilność w <30% do 40% badanych loci.⁵⁶ Warsztaty NCI z 2002 r. uzupełniły te wytyczne, zalecając testowanie dodatkowych markerów mononukleotydowych w guzach z niestabilnością tylko w loci dinukleotydowych, ponieważ markery mononukleotydowe są bardziej wiarygodne w identyfikacji guzów MSI-H.¹²

Histologia

Mecklin i wsp.⁴¹ zgłosili pierwszą systematyczną ocenę histologiczną raka jelita grubego i gruczolaków u pacjentów z "CFS" (zespół rodzinny raka) w 1986 r., wyprzedzając rozpoznanie MSI i genetycznych podstaw zespołu Lyncha o 7 lat. Zauważyli oni zwiększoną częstość występowania raków śluzowych w przypadkach w porównaniu do sporadycznych kontroli (39% vs. 20%). Słabo zróżnicowane guzy również występowały częściej (24% vs. 12%), ale wynik ten nie osiągnął istotności statystycznej. Chociaż liczba gruczolaków była podobna w obu grupach, gruczolaki pacjentów z CFS zawierały dysplazję wyższego stopnia i bardziej znaczący składnik kosmkowy, co sugeruje, że były bardziej "zaawansowane". Od tego czasu szereg typów nowotworów i cech histologicznych zaczęto wiązać z zespołem Lyncha i MSI-H CRC: rak śluzowy, sygnetowaty i rdzeniasty, limfocyty naciekające guz i okołoguzowe, odpowiedź zapalna "podobna do Crohna", słabe zróżnicowanie, heterogeniczność guza i "pchająca" granica guza.^{24,26,41,57-63} Greenson i wsp.^26,62 dodatkowo podkreślili obecność jakiegokolwiek składnika śluzowego, brak brudnej martwicy i dobrze zróżnicowane guzy jako korelujące ze statusem MSI-H.

Zgodnie z konwencją, gruczolakorak śluzowy jest definiowany jako guz składający się w 50% z mucyny, a gruczolakorak z komórek pierścienia sygnetowego jako guz zawierający w 50% komórki pierścienia sygnetowego. Mucyna w gruczolakorakach śluzowych jest głównie zewnątrzkomórkowa, podczas gdy komórki pierścienia sygnetowego zawierają wyraźną mucynę wewnątrzcytoplazmatyczną, zwykle przesuwającą jądro na jedną stronę komórki.⁶⁴ Raki rdzeniaste charakteryzują się konstelacją cech cytoarchitektonicznych, w tym dużym rozmiarem komórek, chromatyną pęcherzykową i wyraźnymi jąderkami, wzrostem przypominającym arkusz lub czasami beleczkowatym oraz ogólnym obwodem. Limfocyty naciekające guz (TIL) są szczególnie widoczne w tym typie guza.⁶⁴

TIL odnoszą się do składnika limfoidalnego ściśle zmieszanego z guzem; wykazano, że składają się one głównie z cytotoksycznych limfocytów T z koekspresją CD3/CD8 [spekuluje się, że ich znaczenie reprezentuje: (1) odpowiedź na obfite tworzenie neoantygenów nowotworowych z powodu "fenotypu mutatora"; oraz (2) możliwą podstawę lepszego rokowania w guzach MSI-H].⁵⁹ Zgłoszono różne metody (i progi) liczenia TIL, w tym ocenę szkiełek barwionych hematoksyliną i eozyną lub CD3. Jedna z praktycznych metod obejmuje skanowanie slajdu w poszukiwaniu regionu z TIL, zliczanie 5 kolejnych pól 40X i obliczanie średniej liczby TIL / pole o dużej mocy (HPF); badania wykorzystujące tę metodę zdefiniowały wynik pozytywny jako > 2 TIL / HPF.⁶² Limfocyty okołoguzowe odnoszą się do mankietu limfoidalnego na przedniej krawędzi guza, podczas gdy reakcja "podobna do Crohna" składa się z "wyraźnych" guzowatych agregatów limfoidalnych na naciekającej krawędzi guza, zwykle identyfikowanych na styku mięśniówki właściwej i okołokomórkowej tkanki tłuszczowej. Progi dla pozytywnej reakcji "podobnej do Crohna" obejmowały "2 lub więcej dużych agregatów limfoidalnych w przekroju", "pojedyncze pole 4X z co najmniej 3 guzkowymi agregatami limfocytów", "co najmniej 3 agregaty limfoidalne na sekcję" i "co najmniej 4 agregaty guzkowe w polu o niskiej mocy (4X)."^26,61,62,65

Guzy są ogólnie klasyfikowane jako dobrze, umiarkowanie lub słabo zróżnicowane. Kryteria Światowej Organizacji Zdrowia stanowią, że guzy o heterogenicznych wzorcach różnicowania powinny być klasyfikowane w oparciu o składnik o najwyższym stopniu zróżnicowania, z ważnym zastrzeżeniem, że ogniska słabego zróżnicowania na przedniej krawędzi guza (tj. pączkowanie guza, przejście nabłonkowo-mezenchymalne) są niewystarczające do zaklasyfikowania guza jako słabo zróżnicowanego.⁶⁴ Heterogeniczność guza odnosi się do obecności 2 lub więcej różnych wzorców wzrostu w obrębie guza; Alexander i współpracownicy podają przykład guza o mieszanych cechach śluzowych i rdzeniastych.⁶⁵ Margines guza "wypychający" lub "ekspansywny" odróżnia się od "naciekającego"; oceny tej najlepiej dokonać przy niskiej mocy.

Testy kliniczne

Testy kliniczne funkcji dMMR w CRC mają 2 potencjalne punkty końcowe: (1) identyfikacja zespołu Lyncha; lub (2) identyfikacja wszystkich MSI-H CRC i jest związana z 2 podstawowymi strategiami badań przesiewowych: (1) wybór pacjentów do badania na podstawie kryteriów klinicznych i/lub patologicznych; lub (2) badanie wszystkich CRC. W tym świetle AC i BG zostały ocenione w kohortach populacyjnych pod kątem ich zdolności do identyfikacji pacjentów z LS. Ogólnie rzecz biorąc, AC-II osiągają czułość rzędu od 40% do 50%, podczas gdy zrewidowane BG działają na poziomie około 90%.^{13-16,20-23,71} Należy podkreślić, że te cechy testu zostały osiągnięte w wyidealizowanych warunkach, z fińskimi badaczami mającymi dostęp do krajowych rejestrów nowotworów i innymi badaczami opisującymi wykorzystanie "szpitalnych genetyków klinicznych" i "szczegółowych kwestionariuszy". Praktyczne bariery w stosowaniu BG obejmują ich złożoność i kaprysy w dokumentowaniu wiarygodnej historii raka w rodzinie.⁷²

Inne ograniczenia obecnych wytycznych klinicznych obejmują ich zmniejszoną czułość w mniejszych rodzinach i populacjach, w których rutynowa kolonoskopia przesiewowa zmienia naturalną historię choroby. Oczywiście strategie te nie są ukierunkowane na większą populację MSI-H CRC.

Jeśli znaczenie predykcyjne statusu MSI-H (tj. znaczenie terapeutyczne) może zostać ostatecznie udowodnione w prospektywnych, randomizowanych, kontrolowanych badaniach klinicznych, wówczas strategia "testowania wszystkich CRC" dla punktu końcowego MSI-H powinna stać się standardem opieki. Badanie MSI jest uważane za "złoty standard" w celu wykazania statusu MSI-H.

Ponieważ nieukierunkowane badanie mutacji linii zarodkowej pod kątem zespołu Lyncha jest zbyt drogie (około 1000 USD/gen), badanie MSI i MMR IHC zostały ocenione jako testy przesiewowe.⁷³ Każdy z tych testów ma związane z nimi zalety i wady. Badanie MSI obejmuje oparte na PCR badanie panelu markerów mikrosatelitarnych w dopasowanej tkance nowotworowej i normalnej (zazwyczaj sąsiadującej nienowotworowej okrężnicy lub krwi obwodowej). Wymaga mikrodysekcji i usług laboratorium diagnostyki molekularnej. Jego niezdolność do zasugerowania konkretnego genu do analizy mutacji jest wyraźną wadą, a jeśli dalsze testy są ograniczone do przypadków MSI-H, może być również nieco mniej czuły niż IHC w identyfikacji LS z powodu mutacji MSH6 (która może występować jako MSI-L CRC).⁷⁴

IHC jest łatwo dostępny w większości diagnostycznych laboratoriów patologii anatomicznej. Przeciwciała przeciwko 4 białkom zaangażowanym w LS (poprzez mutację germinalną powiązanego genu) są dostępne w handlu. Nieprawidłowym wynikiem jest całkowity brak (utrata) immunoreaktywności jądrowej dla jednego lub więcej białek w guzie. Wszystkie 4 białka ulegają normalnej ekspresji w tkance nienowotworowej, a zatem zręby, limfocyty i krypty nienowotworowe służą jako krytyczne kontrole wewnętrzne. Wykazano, że etap odzyskiwania antygenu jest ważny; w jednym z badań nieodpowiednie odzyskiwanie antygenu wiązało się ze słabym barwieniem i słabą swoistością dla LS (podczas gdy wysokie barwienie tła wiązało się ze słabą czułością).⁹⁸ Słabe lub niejednorodne wzory barwienia są czasami spotykane i mogą być związane ze zmiennością utrwalania tkanek lub innymi czynnikami technicznymi. W takich przypadkach pomocne może być powtórzenie badania IHC. Kluczową zaletą stosowania IHC w badaniach przesiewowych Lynch jest jego zdolność do bezpośredniego testowania genów. Utrata funkcji MSH2 (z powodu szkodliwej mutacji) objawia się brakiem ekspresji immunohistochemicznej (IHC) MSH2 i MSH6, podczas gdy utrata funkcji MLH1 (z powodu szkodliwej mutacji lub hipermetylacji promotora) jest wykrywalna jako brak ekspresji immunohistochemicznej MLH1 i PMS2. Izolowany brak białka MSH6 lub PMS2 sugeruje mutację w odpowiednim genie.

Wyniki testów MMR IHC i MSI okazały się w dużej mierze zgodne.^{15,16,22,23,47,48,76-84} W 1 dużym badaniu, łączne zastosowanie MLH1 i MSH2 IHC osiągnęło czułość 92,3% i swoistość 100% dla identyfikacji guzów MSI-H (1144 przebadanych przypadków, z których 302 były MSI-H).⁷⁷ Dodanie MSH6 i PMS2 do panelu powinno prowadzić do dalszego zwiększenia czułości, ponieważ mutacje MSH6 i PMS2 są coraz częściej uznawane za etiologiczne w znacznej mniejszości przypadków Lynch.^{44,45,47,48,79} Potencjalną wadą IHC jest jej niezdolność do wykrywania mutacji missense, które nie destabilizują powstałego mRNA lub białka. Z tego powodu Burgart oszacował maksymalną czułość MMR IHC w wykrywaniu LS na 95%.⁸³ Z naszego doświadczenia wynika, że analiza IHC identyfikuje LS i MSI-H CRC w 90% przypadków; badanie MSI jest podobnie czułe w identyfikacji LS.^{15,16,21-23,82} W guzach wykazujących brak (utratę) ekspresji białka MLH1, przed przystąpieniem do analizy mutacji MLH1 można zastosować dodatkową warstwę testów: Badanie metylacji promotora MLH1 i/lub analiza mutacji BRAF. Każdy z nich wykorzystuje unikalną historię rozwoju sporadycznego MSI-H CRC, jak omówiono wcześniej. W pierwszym przypadku do określenia statusu metylacji promotora MLH1 stosuje się PCR specyficzny dla metylacji. Metylowane przypadki mają prawdopodobnie charakter sporadyczny, a zatem analiza mutacji linii zarodkowej MLH1 może nie być konieczna. Istnieje jedno ważne zastrzeżenie. Chociaż "drugim trafieniem" w większości LS jest utrata heterozygotyczności lub mutacja somatyczna, w rzadkich przypadkach opisano hipermetylację promotora MLH1.^{27,28,68,85,86} Jest to również droższe niż analiza BRAF, a także trudne technicznie.

Somatyczne mutacje aktywujące w BRAF, składniku szlaku kinazy Ras/Raf/MAP, występują w wielu różnych nowotworach ludzkich, w tym w 15% CRC.¹⁴³

Są one często spotykane w gruczolakach ząbkowanych i sporadycznych MSI-H CRC (około 75%) i są uważane za dowód ich ewolucyjnego powiązania.^28,66-69,70 Za większość mutacji odpowiada mutacja punktowa skutkująca substytucją kwasu glutaminowego na walinę w kodonie 600 (V600E); w jednym badaniu CRC, 60/63 (95%) mutacji było V600E.⁶⁶ Tak więc, obecność BRAF V600E w CRC wspiera interpretację, że przypadek jest sporadyczny, a analiza mutacji linii zarodkowej MLH1 zazwyczaj nie jest przeprowadzana. Badanie pojedynczej mutacji punktowej (zamiast sekwencjonowania całego genu) sprawia, że analiza mutacji BRAF jest atrakcyjna ekonomicznie (100 USD).⁷³

Okazjonalnie można zostać poproszonym o ocenę gruczolaków u pacjentów z "możliwym zespołem Lyncha", w otoczeniu silnego wywiadu rodzinnego, w którym tkanka nowotworowa nie jest dostępna do analizy. MMR IHC jest dość czułe i wysoce specyficzne w tym przypadku.^25,87,88 Halvarsson i wsp.⁸⁷ zgłosili utratę ekspresji białka MMR w 23/35 (66%) gruczolaków od 26 pacjentów z "HNPCC" (z których 88% miało potwierdzone mutacje germinalne MMR). Brak barwienia był szczególnie częsty w gruczolakach o wielkości 5 mm (88%). Dziewiętnaście gruczolaków wykazujących utratę białka MMR zawierało jedynie typową dysplazję niskiego stopnia. Wzór nieobecnego barwienia przewidywał zaangażowany gen w każdym przypadku.

Nieobecne barwienie w tej sytuacji klinicznej należy odróżnić od tego obserwowanego w bezszypułkowych ząbkowanych gruczolakach z nałożoną dysplazją cytologiczną (SSAD) (ogólnie akceptowany prekursor sporadycznego MSI-H CRC).⁸⁹ Architektura zmiany i wzór utraty są ważnymi czynnikami. SSAD są ząbkowane (gruczolaki w LS prawie zawsze nie są), mogą wykazywać połączoną utratę MLH1 i PMS2 (nie MSH2 i / lub MSH6), a utrata ekspresji jest ogólnie uważana za późne zdarzenie, często odpowiadające inwazji (podczas gdy utrata ekspresji jest często obserwowana w gruczolakach LS tylko z dysplazją niskiego stopnia).

Wykazanie szkodliwej mutacji germinalnej jest "złotym standardem" w diagnostyce zespołu Lyncha. Pozwala na stosunkowo niedrogą, ukierunkowaną analizę linii germinalnej u członków rodziny. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kwestii. Ogólnie rzecz biorąc, analiza mutacji jest przeprowadzana na podstawie próbki krwi obwodowej, w tym analizy sekwencji eksonów i granic intron-ekson zaangażowanego genu. Większość zgłaszanych mutacji patogennych to mutacje nonsensowne lub z przesunięciem ramki, powodujące skrócenie białka; mutacje missensowne są trudniejsze do sklasyfikowania.⁵¹ Duże delecje mogą stanowić do 20% mutacji patogennych i nie są one wykrywane podczas rutynowego sekwencjonowania. Wielokrotna amplifikacja sondy zależna od ligacji (MLPA) zapewnia ilościową miarę dawki eksonu i jest uważana za metodę z wyboru do wykrywania dużych delecji.^90-93 Przy setkach opisanych mutacji w LS, analiza mutacji jest złożona, a czułość testów, choć stale się poprawia, jest mniejsza niż 100%. W przypadku przekonującego wywiadu rodzinnego, niezdolność do udokumentowania jednoznacznie patogennej mutacji linii zarodkowej nie powinna wykluczać pacjenta z odpowiedniego dla LS nadzoru. Baza danych mutacji zespołu Lyncha jest prowadzona przez International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors (dawniej International Collaborative Group on Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer).⁹⁴

.

Rysunek 4. MSH6 (44) - znakowanie jądrowe komórek gruczolakoraka i prawidłowych komórek nabłonka krypty.

Rysunek 5. PMS2 (EPR3947†) - Zwróć uwagę na normalne znakowanie jądrowe komórek nabłonka krypty (i rozproszonych limfocytów w blaszce właściwej) po prawej stronie i brak znakowania jądrowego w komórkach gruczolakoraka po lewej stronie, co oznacza pozytywny wynik testu (MSI-H).

Znaczenie prognostyczne niedoboru naprawy niedopasowania w raku jelita grubego

Wybieralna korzyść przyznana komórkom nowotworowym przez nabycie niedoboru MMR jest sporna i może, częściowo, odnosić się do zmian w podatności na apoptozę.^95,96,97,98 Zauważono nawet przy początkowym opisie MSI, że pacjenci z guzami MSI-H wydawali się mieć lepsze wskaźniki przeżycia niż ci z guzami MSS.²¹ Od tego czasu przeprowadzono wiele badań dotyczących prognostycznego znaczenia MSI-H w CRC, przy czym większość z nich zgadzała się z początkowymi ustaleniami,^99-102 szczególnie u młodych pacjentów, a kilka badań nie zidentyfikowało statusu MSI jako niezależnego czynnika prognostycznego.^103,104 Pozornym wsparciem wartości prognostycznej statusu MSI jest wysoka częstość występowania aktywowanych śródnabłonkowych cytotoksycznych limfocytów T i zwiększona apoptoza komórek nowotworowych w guzach MSI-H.^99,101 Ta pierwsza cecha może być przypisywana wrodzonej zdolności guzów MSI-H do wytwarzania nowych immunogennych epitopów (jeśli loci B2M i HLA klasy I są nienaruszone i te nowe antygeny mogą być prezentowane), a to może wyjaśniać, dlaczego niektórzy pacjenci z guzami MSI-H mają szczególnie korzystny wynik kliniczny po skutecznych przeciwnowotworowych odpowiedziach immunologicznych.

Znaczenie predykcyjne MSI-H zostało również ocenione w odniesieniu do wyboru pacjentów z CRC, którzy mają otrzymać chemioterapię adiuwantową. Główną wykazaną korelacją jest rozpoznawanie uszkodzeń DNA wywołanych 5-fluorouracylem (5FU) przez nienaruszony system MMR^105-107 w wyniku czego komórki z niedoborem MMR są bardziej oporne na 5-FU niż komórki z niedoborem MMR. Co ciekawe, gdy niedobór MMR był spowodowany hipermetylacją MLH1, komórki odzyskiwały wrażliwość na 5-FU po demetylacji MLH1.¹⁰⁸ Jednak wyraźna rola MSI-H jako predyktora odpowiedzi na chemioterapię jest nadal kontrowersyjna.^109-111

Chociaż testy MSI można stosunkowo łatwo przeprowadzić w laboratoriach diagnostyki molekularnej, istnieją wątpliwości co do klinicznej użyteczności MSI-H jako markera prognostycznego w sporadycznym CRC.^112,113 Ważnym czynnikiem wpływającym na brak osiągnięcia konsensusu jest zmienność rodzaju i liczby markerów mikrosatelitarnych, które zostały ocenione w różnych badaniach. Duża metaanaliza 114 z udziałem 7000 pacjentów wykazała, że istnieje wyraźna korelacja między guzami MSI-H a poprawą przeżycia całkowitego. Jednak badanie to zostało przeprowadzone retrospektywnie, a zatem może być podatne na różne czynniki zakłócające. Możliwe jest również, że różnice w podstawowych szlakach molekularnych LS i sporadycznych guzów MSI-H, jak pokazują dane dotyczące częstotliwości mutacji w Tabeli 1, również odgrywają rolę, a zatem mogą istnieć istotne różnice między LS i sporadycznymi guzami MSI-H, które są zaciemnione przez połączenie ich danych.

Genetic Counseling and Management of Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer

Przy określaniu odpowiedniego czasu na wykonanie badań genetycznych i rozpoczęcie programu nadzoru należy wziąć pod uwagę wiek zachorowania i historię naturalną raka jelita grubego. Początek raka jelita grubego w zespole Lyncha wydaje się występować 15 do 20 lat wcześniej niż w populacji ogólnej.¹⁰ W serii Mecklina w Finlandii¹¹⁹ średni wiek wystąpienia raka jelita grubego wynosił 41 lat, z zakresem wieku od 19 do 83 lat; penetrację genu oszacowano na 89%. W serii Lyncha w Nebrasce średni wiek w momencie diagnozy wynosił 44,4 lat.^117,120 Większość nowotworów występuje przed 60 rokiem życia, ze szczytem w przedziale wiekowym 40-50 lat. Dlatego celem badań genetycznych i programów nadzoru powinna być grupa wiekowa 25-60 lat.^8,117 Większość pacjentów z HNPCC ma mutację w jednym z dwóch genów naprawy niedopasowania DNA, hMSH2 lub hMLH1. Ponad 90% pacjentów z CRC z hMSH2 lub hMLH1 wykazuje wysoką częstotliwość MSI (MSI-H)^121,122; wiele z tych guzów ma błędy replikacji.¹⁴⁴ Wstępne badanie linii zarodkowej jest dopuszczalne u osób z wysokim ryzykiem nosicielstwa mutacji, takich jak pacjenci spełniający kryteria Amsterdam I lub pierwsze trzy kryteria wytycznych Bethesda.¹²³ Każdy pacjent z CRC z osobistym lub rodzinnym wywiadem dotyczącym innego CRC lub raka endometrium, lub u którego zdiagnozowano raka przed 50 rokiem życia, niezależnie od wywiadu osobistego lub rodzinnego, spełnia zmodyfikowane wytyczne.

W dużych badaniach^12,29 porównujących efektywność kosztową kilku strategii badań genetycznych u pacjentów z HNPCC, wykazano, że badanie linii germinalnej u probantów z CRC, którzy spełniają kryteria amsterdamskie, wykrywa najmniej nosicieli genów i ma niski koszt, podczas gdy badanie MSI guza u wszystkich pacjentów z CRC ma najwyższy koszt i wykrywa najwięcej nosicieli genów. Wykazano również, że badanie linii zarodkowej hMSH2/ hMLH1 u pacjentów spełniających kryteria amsterdamskie i analiza MSI guza u pozostałych pacjentów, którzy spełniają zmodyfikowane kryteria, z późniejszym badaniem linii zarodkowej u osób z guzem MSI-H, jest najlepszą strategią pod względem efektywności kosztowej.¹²² Jeśli pacjent spełnia kryteria amsterdamskie I lub podejrzewa się, że należy do rodziny HNPCC, pierwszym badaniem przesiewowym powinna być immunohistochemia w celu wykrycia białek hMLH1 i hMSH2.¹²³

Immunohistochemia jest wykonywana przy użyciu bloków tkankowych zatopionych w parafinie, które są barwione hematoksyliną Mayera. Białka hMLH1 i hMSH2 wybarwiają się pozytywnie w jądrach komórkowych, gdy ulegają ekspresji. Analiza mikrosatelitarna jest zwykle wykonywana za pomocą analizy DNA PCR. Ocenianych jest kilka loci, takich jak BAT26, TGF-RII, D2S119, D3S1612, D5S404, D17S261, BAT25, D2S123, D5S346 i D17S250. Nici DNA guza i normalne DNA są porównywane w sąsiednich pasach. Guzy są uważane za MSI-H (wysoka niestabilność), jeśli dwa lub więcej markerów MS wykazuje niestabilność, MSI-L (niska niestabilność), jeśli jeden marker wykazuje dodatnią niestabilność i MSS (stabilny), jeśli żaden marker nie wykazuje niestabilności.¹²⁴ Jeśli immunohistochemia jest pozytywna, należy wykonać bezpośrednie sekwencjonowanie genomowe ekson po eksonie w celu wykrycia mutacji hMSH2 lub hMLH1. Dwie z najczęściej występujących mutacji to mutacja założycielska 1, delecja genomowa MLH1 obejmująca ekson 16 oraz mutacja założycielska 2, mutacja miejsca splicingu eksonu 6 MLH1 IVS5-1G "A w 454-1.¹²⁵

Jeśli wynik testu jest negatywny, należy przeprowadzić analizę MS. Jeśli ta ostatnia jest negatywna, nie są potrzebne dalsze badania. Jeśli wynik jest pozytywny, należy przeprowadzić analizę mutacji MLH1 i MSH2, którą wykonuje się poprzez sekwencjonowanie kodujących eksonów, w tym flankujących regionów intronowych i regionu promotora^124-126  (Rysunek 2). Żadna z tych trzech metod nie może być stosowana indywidualnie do diagnostyki genetycznej HNPCC. Należy stosować kombinację tych metod i wywiadu rodzinnego. Analiza Southern blot powinna być również stosowana jako test uzupełniający w celu ujawnienia poważnych rearanżacji genomu. W przypadku zidentyfikowania mutacji germinalnej u krewnych dotkniętych chorobą w rodzinie HNPCC, ryzyko zachorowania na raka w ciągu całego życia wynosi 80-85%.¹²⁰ Proces oceny molekularnej obejmuje standardowe i alternatywne techniki wykrywania mutacji (Tabela 3).

Pacjenci powinni zostać poinstruowani o historii naturalnej HNPCC, z analizą zalet dostępnych strategii nadzoru i zarządzania.⁶ Pacjenci muszą zdawać sobie sprawę, że pozytywny wynik może wywołać strach i niepokój w rodzinie. Niektórzy członkowie rodzin z HNPCC mogą już cierpieć z powodu nierozwiązanego żalu z powodu wielu zgonów z powodu raka w ich rodzinach. Osoby te mogą być narażone na niekorzystną reakcję psychologiczną i mogą skorzystać z konsultacji psychiatrycznej.¹²⁰

Wszystkie te osoby z grupy ryzyka powinny zostać poinformowane, że wiek zachorowania na raka w przypadku HNPCC jest zwykle wczesny, ale może być zmienny; dlatego nadzór powinien być kontynuowany przez całe życie. Ponieważ ewolucja gruczolaka jelita grubego do raka jest przyspieszona w HNPCC,^115,121 pacjenci powinni być poddawani ocenie kolonoskopowej co roku, aby zmniejszyć ryzyko rozwoju bardziej zaawansowanego stadium raka.¹¹⁹

Proces oceny molekularnej (Tabela 3)

Standardowe techniki wykrywania mutacji

1. Polimorfizm konformacyjny pojedynczej nici
2. Analiza elektroforezy w gradiencie denaturującym
3. Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie DNA

Alternatywne techniki wykrywania mutacji

1. Monoalleliczna analiza ekspresji
2. analiza Southern
3. ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy

Poradnictwo genetyczne dla członków rodzin wysokiego ryzyka HNPCC powinno rozpocząć się w połowie lat siedemdziesiątych. W rodzinach z tendencją do wczesnego średniego wieku zachorowania na raka, nadzór powinien rozpocząć się w wieku 25 lat. Ze względu na przewagę zmian prawostronnych kolonoskopia całego jelita grubego jest podstawą nadzoru nad HNPCC.^7,116 W doświadczonych rękach do jelita ślepego można dotrzeć w prawie 95% przypadków, podczas gdy wskaźnik perforacji nie przekracza 0,2%.¹⁰ Kolonoskopia oferuje również możliwość pobierania próbek histologicznych i usuwania polipów. Nadzór jest prowadzony do 60. roku życia, a jeśli do tego czasu nie wystąpi fenotypowa ekspresja zespołu, pacjenci są obserwowani zgodnie z zaleceniami American Cancer Society dotyczącymi ryzyka raka jelita grubego w populacji ogólnej. Endoskopowe wyniki ciężkiej dysplazji błony śluzowej lub płaskich gruczolaków wymagają powtórzenia kolonoskopii po 6 miesiącach. Występuje zwiększona częstość synchronicznych i metachronicznych polipów gruczolakowatych, które stanowią zmiany przednowotworowe w tych zespołach Lyncha.¹²⁷ W rodzinach z historią raka w miejscach pozakolonicznych nadzór obejmuje wymaz cytologiczny, przezpochwowe USG jajników i biopsję aspiracyjną endometrium co 1 do 2 lat, począwszy od 30 roku życia. W przypadku nowotworów układu moczowego badania przesiewowe powinny być wykonywane co 1 do 2 lat z analizą moczu, USG, cystoskopią i cytologią moczu. W przypadku nowotworów żołądka i dróg żółciowych przełyk, badania czynności wątroby i przezbrzuszne USG wątroby i dróg żółciowych powinny być wykonywane co 1 do 2 lat, począwszy od 30 roku życia.⁵

W przypadku nowo zdiagnozowanego raka jelita grubego u znanego nosiciela genu lub u osoby wysokiego ryzyka na podstawie wywiadu rodzinnego, subtotalna kolektomia z zespoleniem krętniczo-odbytniczym jest opcją z wyboru ze względu na wysokie ryzyko zmian metachronicznych.^{5,120,128,129} Przy ryzyku raka jelita grubego zbliżającym się do 80-85% przyjęto profilaktyczną kolektomię.⁷⁷ Należy wprowadzić coroczne badanie endoskopowe pozostałej części odbytnicy. Ryzyko rozwoju raka odbytnicy po kolektomii brzusznej szacuje się na 12% po 12 latach.¹³¹ Alternatywnym podejściem może być proktokolektomia, szczególnie w przypadku nosicieli genu hMSH2, u których ryzyko raka odbytnicy jest wyższe niż u nosicieli hMLH1. Resekcja segmentowa jest sugerowana u starszych pacjentów¹³¹ lub u pacjentów z chorobami współistniejącymi, których oczekiwana długość życia jest już ograniczona przez istniejącą chorobę.¹³² W zespole Lyncha II u kobiet preferowaną metodą nadzoru jest przezpochwowe badanie ultrasonograficzne. Jest to nieinwazyjne, łatwo dostępne badanie, które umożliwia pełne zbadanie jamy macicy. Inne metody nadzoru obejmują pobieranie próbek cytologicznych endometrium i biopsję endometrium, gdy jest to wskazane. U kobiet z zespołem Lyncha II, które są podatne na rozwój raka endometrium i ukończyły rodzinę lub są po menopauzie, należy rozważyć całkowitą histerektomię brzuszną z obustronną salpingooforektomią.^{5,120,127,132,133}

Lekarze powinni poświęcić czas na poinformowanie pacjentek o historii naturalnej tego dziedzicznego zespołu nowotworowego, omówienie ich obaw i lęków związanych z rakiem oraz poinformowanie ich o zaletach i wadach testów genetycznych.

Rokowanie

Ogólne doświadczenia kilku ośrodków z długoterminową obserwacją pacjentów z HNPCC leczonych z powodu CRC są zachęcające. W kilku badaniach odnotowano poprawę wskaźnika 5-letniego przeżycia wśród pacjentów z HNPCC z rakiem jelita grubego.^{118,119,134,135} W 1996 roku Sankila i wsp. przebadali 175 pacjentów z HNPCC i porównali ich pod względem przeżycia z populacją 14 086 pacjentów ze sporadycznym rakiem jelita grubego.¹³⁶ Rozpoznanie zespołu opierało się na wykryciu mutacji linii zarodkowej w genie naprawy niedopasowania. Wskaźnik 5-letniego przeżycia dla pacjentów z HNPCC wynosił 65%, w porównaniu do 44% dla przypadków sporadycznych. Rok później Watson i wsp.¹³⁷ dostarczyli dodatkowych danych na temat rokowania u pacjentów z HNPCC. Przebadali oni retrospektywnie kohortę pacjentów z HNPCC i porównali ich z populacją pacjentów ze sporadycznym rakiem jelita grubego. Stwierdzili oni, że w ciągu pierwszych 10 lat po diagnozie śmiertelność w przypadkach HNPCC była prawie o dwie trzecie wyższa niż w przypadku raka sporadycznego. Niedawno rejestr nowotworów Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) opublikował podobne wyniki; przeżycie skorygowane o wiek było wyższe u nosicieli HNPCC z rakiem jelita grubego niż u pacjentów ze sporadycznym rakiem jelita grubego.^138,139 Oczekiwana długość życia była o jedną trzecią wyższa u pacjentów z HNPCC i rakiem we wczesnym stadium niż w sporadycznych przypadkach; jednak oczekiwana długość życia zmniejszała się wraz z bardziej zaawansowanymi stadiami w momencie diagnozy.¹⁴⁰

Biologiczne podstawy tych ustaleń nie zostały jeszcze wyjaśnione. Zaproponowano, że mniej agresywne zachowanie nowotworów HNPCC może być paradoksalnym efektem niestabilności genomowej.¹⁴¹ W ten sposób podstawowe funkcje komórek złośliwych, a zwłaszcza ich potencjał przerzutowy, mogą być hamowane przez bardzo znaczące obciążenie mutacyjne. Ponadto interakcje gen-gen i gen-środowisko mogą odgrywać ważną rolę w historii naturalnej HNPCC. Systematyczny nadzór i indywidualnie zaprojektowane leczenie pacjentów dotkniętych chorobą może pomóc wykryć nowotwory na wcześniejszym etapie, a następnie jeszcze bardziej poprawić rokowanie choroby.

Referencje

1. Nischan P. 1983. Cancer Incidence in Five Continents. Vol. IV. Herausgegeben von J. Waterhouse, C. Muir, K. Shanmugaratnam und J. Powell. 812 Seiten, 146 Abb., 354 Tab. (IARC Scientific Publications No. 42). IARC, Lyon 1982. Preis: 100,- Sw.fr.; 50,- $. Nahrung. 27(9):846-846. https://doi.org/10.1002/food.19830270910

2. Whittenmore AS, Zhong S, Wu A. 1985. Colorectal cancer in Chinese and Chinese-Americans. NCI Monogr. 6943-55.

3. Lynch HT, Bronson EK, Strayhorn PC, Smyrk TC, Lynch JF, Ploetner EJ. 1990. Genetic diagnosis of Lynch syndrome II in an extended colorectal cancer-prone family. Cancer. 662233-2238.

4. Lynch HT. 1986. Frequency of hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (Lynch syndromes I and II). Gastroenterology. 90(2):486-489. https://doi.org/10.1016/0016-5085(86)90952-2

5. Thorson AG, Knezetic JA, Lynch HT. 1999. A century of progress in hereditary nonpolyposis colorectal cancer (lynch syndrome). Diseases of the Colon & Rectum. 42(1):1-9. https://doi.org/10.1007/bf02235175

6. Lynch HT, Smyrk T, Lynch JF. 1998. Molecular Genetics and Clinical-Pathology Features of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Carcinoma (Lynch Syndrome). Oncology. 55(2):103-108. https://doi.org/10.1159/000011843

7. Cai S. 2003. Clinical characteristics and diagnosis of patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. WJG. 9(2):284. https://doi.org/10.3748/wjg.v9.i2.284

8. T. Lynch H, Taylor RJ, Lynch JF, Knezetic JA, Barrows A, Fodde R, Wijnen J, Wagner A. 2003. Multiple Primary Cancer, Including Transitional Cell Carcinoma of the Upper Uroepithelial Tract in a Multigeneration Hnpcc Family: Molecular Genetic, Diagnostic, and Management Implications. Am J Gastroenterology. 98(3):664-670. https://doi.org/10.1111/j.1572-0241.2003.07329.x

9. Vasen H, Watson P, Mecklin J, Lynch H. 1999. New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative Group on HNPCC?. Gastroenterology. 116(6):1453-1456. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(99)70510-x

10. Lynch HT, Lanspa SJ, Boman BM, Smyrk T, Lynch JF. 1988. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer—Lynch syndromes I and II. Gastroenterol Clin North Am. 17679-712.

11. Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Srivastava S, Jass JR, Khan PM, Lynch H, Smyrk T, Perucho M, et al. 1997. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome: Meeting Highlights and Bethesda Guidelines. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 89(23):1758-1762. https://doi.org/10.1093/jnci/89.23.1758

12. Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, Chapelle Adl, Ruschoff J, Fishel R, Lindor NM, Burgart LJ, Hamelin R, et al. 2004. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 96(4):261-268. https://doi.org/10.1093/jnci/djh034

13. Julié C, Trésallet C, Brouquet A, Vallot C, Zimmermann U, Mitry E, Radvanyi F, Rouleau E, Lidereau R, Coulet F, et al. 2008. Identification in Daily Practice of Patients With Lynch Syndrome (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer): Revised Bethesda Guidelines-Based ApproachVersusMolecular Screening. 103(11):2825-2835. https://doi.org/10.1111/j.1572-0241.2008.02084.x

14. Salovaara R, Loukola A, Kristo P, Kääriäinen H, Ahtola H, Eskelinen M, Härkönen N, Julkunen R, Kangas E, Ojala S, et al. 2000. Population-Based Molecular Detection of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. JCO. 18(11):2193-2200. https://doi.org/10.1200/jco.2000.18.11.2193

15. Hampel H, Frankel WL, Martin E, Arnold M, Khanduja K, Kuebler P, Nakagawa H, Sotamaa K, Prior TW, Westman J, et al. 2005. Screening for the Lynch Syndrome (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer). N Engl J Med. 352(18):1851-1860. https://doi.org/10.1056/nejmoa043146

16. Hampel H, Frankel WL, Martin E, Arnold M, Khanduja K, Kuebler P, Clendenning M, Sotamaa K, Prior T, Westman JA, et al. 2008. Feasibility of Screening for Lynch Syndrome Among Patients With Colorectal Cancer. JCO. 26(35):5783-5788. https://doi.org/10.1200/jco.2008.17.5950

17. LYNCH HT. 1966. Hereditary Factors in Cancer. Arch Intern Med. 117(2):206. https://doi.org/10.1001/archinte.1966.03870080050009

18. Lynch HT, Krush AJ. 1971. Cancer family “G’’ revisited: 1895- 1970. Cancer. 271505-1511.

19. Vasen HFA, Mecklin J-, Meera Khan P, Lynch HT. 1991. The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC). Diseases of the Colon & Rectum. 34(5):424-425. https://doi.org/10.1007/bf02053699

20. Aaltonen LA, Salovaara R, Kristo P, Canzian F, Hemminki A, Peltomäki P, Chadwick RB, Kääriäinen H, Eskelinen M, Järvinen H, et al. 1998. Incidence of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer and the Feasibility of Molecular Screening for the Disease. N Engl J Med. 338(21):1481-1487. https://doi.org/10.1056/nejm199805213382101

21. Debniak T, Kurzawski G, Gorski B, Kladny J, Domagala W, Lubinski J. 2000. Value of pedigree/clinical data, immunohistochemistry and microsatellite instability analyses in reducing the cost of determining hMLH1 and hMSH2 gene mutations in patients with colorectal cancer. European Journal of Cancer. 36(1):49-54. https://doi.org/10.1016/s0959-8049(99)00208-7

22. Cunningham JM, Kim C, Christensen ER, Tester DJ, Parc Y, Burgart LJ, Halling KC, McDonnell SK, Schaid DJ, Walsh Vockley C, et al. 2001. The Frequency of Hereditary Defective Mismatch Repair in a Prospective Series of Unselected Colorectal Carcinomas. The American Journal of Human Genetics. 69(4):780-790. https://doi.org/10.1086/323658

23. Piñol V. 2005. Accuracy of Revised Bethesda Guidelines, Microsatellite Instability, and Immunohistochemistry for the Identification of Patients With Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. JAMA. 293(16):1986. https://doi.org/10.1001/jama.293.16.1986

24. Kim H, Jen J, Vogelstein B. 1994. Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am J Pathol. 145148-156.

25. Aaltonen LA, Peltomaki P, Mecklin JP. 1994. Replication errors in benign and malignant tumors from hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients. Cancer Res. 541645-1648.

26. Jenkins MA, Hayashi S, O?Shea A, Burgart LJ, Smyrk TC, Shimizu D, Waring PM, Ruszkiewicz AR, Pollett AF, Redston M, et al. 2007. Pathology Features in Bethesda Guidelines Predict Colorectal Cancer Microsatellite Instability: A Population-Based Study. Gastroenterology. 133(1):48-56. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2007.04.044

27. Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JJ, Markowitz S, Willson JKV, Hamilton SR, Kinzler KW, et al. 1998. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95(12):6870-6875. https://doi.org/10.1073/pnas.95.12.6870

28. Deng G. 2004. BRAF Mutation Is Frequently Present in Sporadic Colorectal Cancer with Methylated hMLH1, But Not in Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Clinical Cancer Research. 10(1):191-195. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-1118-3

29. Lynch HT, Smyrk T, Lynch JF. 1998. Molecular Genetics and Clinical-Pathology Features of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Carcinoma (Lynch Syndrome). Oncology. 55(2):103-108. https://doi.org/10.1159/000011843

30. Cantor D. 2006. The Frustrations of Families: Henry Lynch, Heredity, and Cancer Control, 1962?1975. Med. Hist.. 50(3):279-302. https://doi.org/10.1017/s0025727300009996

31. Aaltonen L, Peltomaki P, Leach F, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J, Jarvinen H, Powell S, Jen J, Hamilton, et al. 1993. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science. 260(5109):812-816. https://doi.org/10.1126/science.8484121

32. Thibodeau S, Bren G, Schaid D. 1993. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science. 260(5109):816-819. https://doi.org/10.1126/science.8484122

33. Fishel R, Lescoe MK, Rao M, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, Kane M, Kolodner R. 1993. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell. 75(5):1027-1038. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90546-3

34. Leach FS, Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Jen J, Parsons R, Peltomäki P, Sistonen P, Aaltonen LA, Nyström-Lahti M, et al. 1993. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cell. 75(6):1215-1225. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90330-s

35. Lindblom A, Tannergård P, Werelius B, Nordenskjöld M. 1993. Genetic mapping of a second locus predisposing to hereditary non?polyposis colon cancer. Nat Genet. 5(3):279-282. https://doi.org/10.1038/ng1193-279

36. Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, Warren G, Smith LG, Lescoe MK, Kane M, Earabino C, Lipford J, Lindblom A, et al. 1994. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH 1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature. 368(6468):258-261. https://doi.org/10.1038/368258a0

37. Papadopoulos N, Nicolaides N, Wei Y, Ruben S, Carter K, Rosen C, Haseltine W, Fleischmann R, Fraser C, Adams M, et al. 1994. Mutation of a mutL homolog in hereditary colon cancer. Science. 263(5153):1625-1629. https://doi.org/10.1126/science.8128251

38. Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Weit Y, Carter KC, Ruben SM, Rosen CA, Haseltine WA, Fleischmann RD, Fraser CM, et al. 1994. Mutations of two P/WS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature. 371(6492):75-80. https://doi.org/10.1038/371075a0

39. Akiyama Y, Sato H, Yamada T. 1997. Germ-line mutation of the hMSH6/GTBP gene in an atypical hereditary nonpolyposis colorectal cancer kindred. Cancer Res. 573920-3923.

40. Miyaki M, Konishi M, Tanaka K, Kikuchi-Yanoshita R, Muraoka M, Yasuno M, Igari T, Koike M, Chiba M, Mori T. 1997. Germline mutation of MSH6 as the cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 17(3):271-272. https://doi.org/10.1038/ng1197-271

41. Mecklin J, Sipponen P, Järvinen HJ. 1986. Histopathology of colorectal carcinomas and adenomas in cancer family syndrome. Diseases of the Colon & Rectum. 29(12):849-853. https://doi.org/10.1007/bf02555362

42. Strand M, Prolla TA, Liskay RM, Petes TD. 1993. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature. 365(6443):274-276. https://doi.org/10.1038/365274a0

43. MARRA G, SCHÄR P. 1999. Recognition of DNA alterations by the mismatch repair system. 338(1):1-13. https://doi.org/10.1042/bj3380001

44. Berends MJ, Wu Y, Sijmons RH, Mensink RG, van der Sluis T, Hordijk-Hos JM, de Vries EG, Hollema H, Karrenbeld A, Buys CHC, et al. 2002. Molecular and Clinical Characteristics of MSH6 Variants: An Analysis of 25 Index Carriers of a Germline Variant. The American Journal of Human Genetics. 70(1):26-37. https://doi.org/10.1086/337944

45. Plaschke J, Engel C, Krüger S, Holinski-Feder E, Pagenstecher C, Mangold E, Moeslein G, Schulmann K, Gebert J, von Knebel Doeberitz M, et al. 2004. Lower Incidence of Colorectal Cancer and Later Age of Disease Onset in 27 Families With Pathogenic MSH6 Germline Mutations Compared With Families With MLH1 or MSH2 Mutations: The German Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Consortium. JCO. 22(22):4486-4494. https://doi.org/10.1200/jco.2004.02.033

46. Kariola R, Hampel H, Frankel WL, Raevaara TE, de la Chapelle A, Nyström-Lahti M. 2004. MSH6 missense mutations are often associated with no or low cancer susceptibility. Br J Cancer. 91(7):1287-1292. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6602129

47. Gill S. 2005. Isolated Loss of PMS2 Expression in Colorectal Cancers: Frequency, Patient Age, and Familial Aggregation. Clinical Cancer Research. 11(18):6466-6471. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-05-0661

48. Truninger K, Menigatti M, Luz J, Russell A, Haider R, Gebbers J, Bannwart F, Yurtsever H, Neuweiler J, Riehle H, et al. 2005. Immunohistochemical Analysis Reveals High Frequency of PMS2 Defects in Colorectal Cancer. Gastroenterology. 128(5):1160-1171. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2005.01.056

49. Senter L, Clendenning M, Sotamaa K, Hampel H, Green J, Potter JD, Lindblom A, Lagerstedt K, Thibodeau SN, Lindor NM, et al. 2008. The Clinical Phenotype of Lynch Syndrome Due to Germ-Line PMS2 Mutations. Gastroenterology. 135(2):419-428.e1. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2008.04.026

50. Chang DK, Ricciardiello L, Goel A, Chang CL, Boland CR. 2000. Steady-state Regulation of the Human DNA Mismatch Repair System. J. Biol. Chem.. 275(24):18424-18431. https://doi.org/10.1074/jbc.m001140200

51. Peltomäki P, Vasen H. 2004. Mutations Associated with HNPCC Predisposition ? Update of ICG-HNPCC/INSiGHT Mutation Database. Disease Markers. 20(4-5):269-276. https://doi.org/10.1155/2004/305058

52. Markowitz S, Wang J, Myeroff L, Parsons R, Sun L, Lutterbaugh J, Fan R, Zborowska E, Kinzler K, Vogelstein B, et al. 1995. Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science. 268(5215):1336-1338. https://doi.org/10.1126/science.7761852

53. Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, Perucho M. 1997. Somatic Frameshift Mutations in theBAXGene in Colon Cancers of the Microsatellite Mutator Phenotype. Science. 275(5302):967-969. https://doi.org/10.1126/science.275.5302.967

54. Souza RF, Appel R, Yin J, Wang S, Smolinski KN, Abraham JM, Zou T, Shi Y, Lei J, Cottrell J, et al. 1996. Microsatellite instability in the insulin?like growth factor II receptor gene in gastrointestinal tumours. Nat Genet. 14(3):255-257. https://doi.org/10.1038/ng1196-255

55. Malkhosyan S, Rampino N, Yamamoto H, Perucho M. 1996. Frameshift mutator mutations. Nature. 382(6591):499-500. https://doi.org/10.1038/382499a0

56. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR. 1998. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.. Cancer Res. 585248-5257.

57. Jass JR, Smyrk TC, Stewart SM. 1994. Pathology of hereditary non-polyposis colorectal cancer. Anticancer Res. 141631-1634.

58. Jass JR, Do K, Simms LA, Iino H, Wynter C, Pillay SP, Searle J, Radford-Smith G, Young J, Leggett B. 1998. Morphology of sporadic colorectal cancer with DNA replication errors. Gut. 42(5):673-679. https://doi.org/10.1136/gut.42.5.673

59. Michael-Robinson JM. 2001. Tumour infiltrating lymphocytes and apoptosis are independent features in colorectal cancer stratified according to microsatellite instability status. 48(3):360-366. https://doi.org/10.1136/gut.48.3.360

60. Smyrk TC, Watson P, Kaul K. 2001. Tumor-infiltrating lymphocytes are a marker for microsatellite instability in colorectal carcinoma. Cancer. 912417-2422.

61. Young J, Simms LA, Biden KG, Wynter C, Whitehall V, Karamatic R, George J, Goldblatt J, Walpole I, Robin S, et al. 2001. Features of Colorectal Cancers with High-Level Microsatellite Instability Occurring in Familial and Sporadic Settings. The American Journal of Pathology. 159(6):2107-2116. https://doi.org/10.1016/s0002-9440(10)63062-3

62. Greenson JK, Bonner JD, Ben-Yzhak O, Cohen HI, Miselevich I, Resnick MB, Trougouboff P, Tomsho LD, Kim E, Low M, et al. 2003. Phenotype of Microsatellite Unstable Colorectal Carcinomas: Well-Differentiated and Focally Mucinous Tumors and the Absence of Dirty Necrosis Correlate With Microsatellite Instability. The American Journal of Surgical Pathology. 27(5):563-570. https://doi.org/10.1097/00000478-200305000-00001

63. Yearsley M, Hampel H, Lehman A, Nakagawa H, de la Chapelle A, Frankel WL. 2006. Histologic features distinguish microsatellite-high from microsatellite-low and microsatellite-stable colorectal carcinomas, but do not differentiate germline mutations from methylation of the MLH1 promoter. Human Pathology. 37(7):831-838. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2006.02.009

64. Hamilton SR, Vogelstein B, Kudo S. 2000. Carcinoma of the colon and rectum. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System.. Lyon: IARC Press.

65. Alexander J, Watanabe T, Wu T, Rashid A, Li S, Hamilton SR. 2001. Histopathological Identification of Colon Cancer with Microsatellite Instability. The American Journal of Pathology. 158(2):527-535. https://doi.org/10.1016/s0002-9440(10)63994-6

66. Wang L, Cunningham JM, Winters JL. 2003. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer Res. 635209-5212.

67. Kambara T. 2004. BRAF mutation is associated with DNA methylation in serrated polyps and cancers of the colorectum. Gut. 53(8):1137-1144. https://doi.org/10.1136/gut.2003.037671

68. McGivern A, Wynter CV, Whitehall VL. 2004. Promoter hypermethylation frequency and BRAF mutations distinguish hereditary non-polyposis colon cancer from sporadic MSI-H colon cancer. Fam Cancer. 3101-107.

69. Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K, Cullings HM, Takeda M, Kimura K, Kambara T, MacPhee DG, Young J, Leggett BA, et al. 2004. Colorectal Cancer With Mutation in BRAF, KRAS, and Wild-Type With Respect to Both Oncogenes Showing Different Patterns of DNA Methylation. JCO. 22(22):4584-4594. https://doi.org/10.1200/jco.2004.02.154

70. O??Brien MJ, Yang S, Mack C, Xu H, Huang CS, Mulcahy E, Amorosino M, Farraye FA. 2006. Comparison of Microsatellite Instability, CpG Island Methylation Phenotype, BRAF and KRAS Status in Serrated Polyps and Traditional Adenomas Indicates Separate Pathways to Distinct Colorectal Carcinoma End Points. The American Journal of Surgical Pathology. 30(12):1491-1501. https://doi.org/10.1097/01.pas.0000213313.36306.85

71. Kievit W, De Bruin J, Adang E, Ligtenberg M, Nagengast F, Van Krieken J, Hoogerbrugge N. Current clinical selection strategies for identification of hereditary non-polyposis colorectal cancer families are inadequate: a meta-analysis. 65(4):308-316. https://doi.org/10.1111/j.1399-0004.2004.00220.x

72. Mitchell RJ. 2004. Accuracy of reporting of family history of colorectal cancer. Gut. 53(2):291-295. https://doi.org/10.1136/gut.2003.027896

73. Palomaki GE, McClain MR, Melillo S, Hampel HL, Thibodeau SN. 2009. EGAPP supplementary evidence review: DNA testing strategies aimed at reducing morbidity and mortality from Lynch syndrome. Genet Med. 11(1):42-65. https://doi.org/10.1097/gim.0b013e31818fa2db

74. Wu Y, Berends MJ, Mensink RG, Kempinga C, Sijmons RH, van der Zee AG, Hollema H, Kleibeuker JH, Buys CH, Hofstra RM. 1999. Association of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer?Related Tumors Displaying Low Microsatellite Instability with MSH6 Germline Mutations. The American Journal of Human Genetics. 65(5):1291-1298. https://doi.org/10.1086/302612

75. Müller W, Burgart LJ, Krause-Paulus R, Thibodeau SN, Almeida M, Edmonston TB, Boland CR, Sutter C, Jass JR, Lindblom A, et al. 2001. 1(2):87-93. https://doi.org/10.1023/a:1013840907881

76. Marcus VA, Madlensky L, Gryfe R, Kim H, So K, Millar A, Temple LK, Hsieh E, Hiruki T, Narod S, et al. 1999. Immunohistochemistry for hMLH1 and hMSH2: A Practical Test for DNA Mismatch Repair-Deficient Tumors. The American Journal of Surgical Pathology. 23(10):1248. https://doi.org/10.1097/00000478-199910000-00010

77. Lindor NM, Burgart LJ, Leontovich O, Goldberg RM, Cunningham JM, Sargent DJ, Walsh-Vockley C, Petersen GM, Walsh MD, Leggett BA, et al. 2002. Immunohistochemistry Versus Microsatellite Instability Testing in Phenotyping Colorectal Tumors. JCO. 20(4):1043-1048. https://doi.org/10.1200/jco.2002.20.4.1043

78. Kakar S, Burgart LJ, Thibodeau SN, Rabe KG, Petersen GM, Goldberg RM, Lindor NM. 2003. Frequency of loss ofhMLH1 expression in colorectal carcinoma increases with advancing age. Cancer. 97(6):1421-1427. https://doi.org/10.1002/cncr.11206

79. de Jong AE. 2004. Microsatellite Instability, Immunohistochemistry, and Additional PMS2 Staining in Suspected Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Clinical Cancer Research. 10(3):972-980. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-0956-3

80. Lagerstedt K, Nilbert M, Halvarsson B, Lindblom A, Rambech E. 2004. Microsatellite instability analysis and/or immunostaining for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer?. Virchows Archiv. 444(2):135-141. https://doi.org/10.1007/s00428-003-0922-z

81. CHAI S, ZEPS N, SHEARWOOD A, GRIEU F, CHARLES A, HARVEY J, GOLDBLATT J, JOSEPH D, IACOPETTA B. 2004. Screening for defective DNA mismatch repair in stage II and III colorectal cancer patients. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 2(11):1017-1025. https://doi.org/10.1016/s1542-3565(04)00451-3

82. Southey MC, Jenkins MA, Mead L, Whitty J, Trivett M, Tesoriero AA, Smith LD, Jennings K, Grubb G, Royce SG, et al. 2005. Use of Molecular Tumor Characteristics to Prioritize Mismatch Repair Gene Testing in Early-Onset Colorectal Cancer. JCO. 23(27):6524-6532. https://doi.org/10.1200/jco.2005.04.671

83. Burgart LJ. 2005. Testing for defective DNA mismatch repair in colorectal carcinoma: a practical guide. Arch Pathol Lab Med. 1291385-1389.

84. Ward RL, Turner J, Williams R, Pekarsky B, Packham D, Velickovic M, Meagher A, O'Connor T, Hawkins NJ. 2005. Routine testing for mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer is justified. J. Pathol.. 207(4):377-384. https://doi.org/10.1002/path.1851

85. Hemminki A, Peltomäki P, Mecklin J, Järvinen H, Salovaara R, Nyström-Lahti M, de la Chapelle A, Aaltonen LA. 1994. Loss of the wild type MLH1 gene is a feature of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 8(4):405-410. https://doi.org/10.1038/ng1294-405

86. Liu B, Nicolaides NC, Markowitz S, Willson JK, Parsons RE, Jen J, Papadopolous N, Peltomäki P, de la Chapelle A, Hamilton SR, et al. 1995. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet. 9(1):48-55. https://doi.org/10.1038/ng0195-48

87. Halvarsson B, Lindblom A, Johansson L, Lagerstedt K, Nilbert M. 2005. Loss of mismatch repair protein immunostaining in colorectal adenomas from patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Mod Pathol. 18(8):1095-1101. https://doi.org/10.1038/modpathol.3800392

88. Iino H. 2000. DNA microsatellite instability and mismatch repair protein loss in adenomas presenting in hereditary non-polyposis colorectal cancer. 47(1):37-42. https://doi.org/10.1136/gut.47.1.37

89. Sheridan TB, Fenton H, Lewin MR, Burkart AL, Iacobuzio-Donahue CA, Frankel WL, Montgomery E. 2006. Sessile Serrated Adenomas With Low- and High-Grade Dysplasia and Early Carcinomas. Am J Clin Pathol. 126(4):564-571. https://doi.org/10.1309/c7je8bvl8420v5vt

90. Gille JJP, Hogervorst FBL, Pals G, Wijnen JT, van Schooten RJ, Dommering CJ, Meijer GA, Craanen ME, Nederlof PM, de Jong D, et al. 2002. Genomic deletions of MSH2 and MLH1 in colorectal cancer families detected by a novel mutation detection approach. Br J Cancer. 87(8):892-897. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6600565

91. Wijnen J, van der Klift H, Vasen H, Khan PM, Menko F, Tops C, Meijers Heijboer H, Lindhout D, Møller P, Fodde. R. 1998. MSH2 genomic deletions are a frequent cause of HNPCC. Nat Genet. 20(4):326-328. https://doi.org/10.1038/3795

92. Nakagawa H, Hampel H, Chapelle Adl. 2003. Identification and characterization of genomic rearrangements ofMSH2 andMLH1 in Lynch syndrome (HNPCC) by novel techniques. Hum. Mutat.. 22(3):258-258. https://doi.org/10.1002/humu.9171

93. Balmaña J, Stockwell DH, Steyerberg EW, Stoffel EM, Deffenbaugh AM, Reid JE, Ward B, Scholl T, Hendrickson B, Tazelaar J, et al. 2006. Prediction of MLH1 and MSH2 Mutations in Lynch Syndrome. JAMA. 296(12):1469. https://doi.org/10.1001/jama.296.12.1469

94. InSiGHT DNA Variant Database. [Internet]. Harrow, Middlesex HA1 3UJ, UK: International Society for Hereditary Gastrointestinal Tumours.[cited 16 Sep 2020]. Available from: http://www.insight-database.org/genes

95. Tomlinson IPM, Novelli MR, Bodmer WF. 1996. The mutation rate and cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93(25):14800-14803. https://doi.org/10.1073/pnas.93.25.14800

96. Toft NJ, Curtis LJ, Sansom OJ, Leitch AL, Wyllie AH, te Riele H, Arends MJ, Clarke AR. 2002. Heterozygosity for p53 promotes microsatellite instability and tumorigenesis on a Msh2 deficient background. Oncogene. 21(41):6299-6306. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1205727

97. Fishel R. 2001. The selection for mismatch repair defects in hereditary nonpolyposis colorectal cancer: revising the mutator hypothesis. Cancer Res. 617369-7374.

98. Tomlinson I, Bodmer W. 1999. Selection, the mutation rate and cancer: Ensuring that the tail does not wag the dog. Nat Med. 5(1):11-12. https://doi.org/10.1038/4687

99. Benatti P. 2005. Microsatellite Instability and Colorectal Cancer Prognosis. Clinical Cancer Research. 11(23):8332-8340. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-05-1030

100. Guidoboni M, Gafà R, Viel A, Doglioni C, Russo A, Santini A, Del Tin L, Macrì E, Lanza G, Boiocchi M, et al. 2001. Microsatellite Instability and High Content of Activated Cytotoxic Lymphocytes Identify Colon Cancer Patients with a Favorable Prognosis. The American Journal of Pathology. 159(1):297-304. https://doi.org/10.1016/s0002-9440(10)61695-1

101. Samowitz WS, Curtin K, Ma KN. 2001. Microsatellite instability in sporadic colon cancer is associated with an improved prognosis at the population level. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.. 10917-923.

102. Watanabe Y, Nakajima H, Nozaki K, Ueda H, Obata K, Hoshiai H, Noda K. 2001. Clinicopathologic and Immunohistochemical Features and Microsatellite Status of Endometrial Cancer of the Uterine Isthmus. International Journal of Gynecological Pathology. 20(4):368-373. https://doi.org/10.1097/00004347-200110000-00009

103. Ward RL, Cheong K, Ku S, Meagher A, O?Connor T, Hawkins NJ. 2003. Adverse Prognostic Effect of Methylation in Colorectal Cancer Is Reversed by Microsatellite Instability. JCO. 21(20):3729-3736. https://doi.org/10.1200/jco.2003.03.123

104. Salahshor S, Kressner U, Fischer H, Lindmark G, Glimelius B, Påhlman L, Lindblom A. 1999. Microsatellite instability in sporadic colorectal cancer is not an independent prognostic factor. Br J Cancer. 81(2):190-193. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6690676

105. Carethers JM, Chauhan DP, Fink D, Nebel S, Bresalier RS, Howell SB, Boland C. 1999. Mismatch repair proficiency and in vitro response to 5-fluorouracil. Gastroenterology. 117(1):123-131. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(99)70558-5

106. Tajima A, Hess MT, Cabrera BL, Kolodner RD, Carethers JM. 2004. The mismatch repair complex hMutS? recognizes 5-fluorouracil-modified DNA: Implications for chemosensitivity and resistance. Gastroenterology. 127(6):1678-1684. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2004.10.001

107. Meyers M, Wagner MW, Mazurek A, Schmutte C, Fishel R, Boothman DA. 2005. DNA Mismatch Repair-dependent Response to Fluoropyrimidine-generated Damage. J. Biol. Chem.. 280(7):5516-5526. https://doi.org/10.1074/jbc.m412105200

108. Arnold CN, Goel A, Boland CR. 2003. Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5-fluorouracil in colorectal cancer cell lines. Int. J. Cancer. 106(1):66-73. https://doi.org/10.1002/ijc.11176

109. Hemminki A, Mecklin J, Järvinen H, Aaltonen LA, Joensuu H. 2000. Microsatellite instability is a favorable prognostic indicator in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Gastroenterology. 119(4):921-928. https://doi.org/10.1053/gast.2000.18161

110. Halling KC, French AJ, McDonnell SK, Burgart LJ, Schaid DJ, Peterson BJ, Moon-Tasson L, Mahoney MR, Sargent DJ, O'Connell MJ, et al. 1999. Microsatellite Instability and 8p Allelic Imbalance in Stage B2 and C Colorectal Cancers. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 91(15):1295-1303. https://doi.org/10.1093/jnci/91.15.1295

111. Elsaleh H, Powell B, Soontrapornchai P, Joseph D, Goria F, Spry N, Iacopetta B. 2000. p53 Gene Mutation, Microsatellite Instability and Adjuvant Chemotherapy: Impact on Survival of 388 Patients with Dukes? C Colon Carcinoma. Oncology. 58(1):52-59. https://doi.org/10.1159/000012079

112. Boland CR. 2007. Clinical Uses of Microsatellite Instability Testing in Colorectal Cancer: An Ongoing Challenge. JCO. 25(7):754-756. https://doi.org/10.1200/jco.2006.09.4607

113. Kim GP, Colangelo LH, Wieand HS, Paik S, Kirsch IR, Wolmark N, Allegra CJ. 2007. Prognostic and Predictive Roles of High-Degree Microsatellite Instability in Colon Cancer: A National Cancer Institute?National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Collaborative Study. JCO. 25(7):767-772. https://doi.org/10.1200/jco.2006.05.8172

114. Popat S, Hubner R, Houlston R. 2005. Systematic Review of Microsatellite Instability and Colorectal Cancer Prognosis. JCO. 23(3):609-618. https://doi.org/10.1200/jco.2005.01.086

115. Graham DM, Appelman HD. 1990. Crohn’s- like lymphoid reaction and colorectal carcinoma. A potential histologic prognosticator. Mod Pathol. 3332-335.

116. Lynch HT, de la Chapelle A. 2003. Hereditary Colorectal Cancer. N Engl J Med. 348(10):919-932. https://doi.org/10.1056/nejmra012242

117. Watson P, Lin KM, Rodriguez-Bigas MA, Smyrk T, Lemon S, Shashidharan M, Franklin B. 1998. Colorectal carcinoma survival among Hereditary Nonpolyposis Colorectal Carcinoma family members. Cancer. 83259-266.

118. Pucciarelli S, Agostini M, Viel A, Bertorelle R, Russo V, Toppan P, Lise M. 2003. Early-Age-at-Onset Colorectal Cancer and Microsatellite Instability as Markers of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Diseases of the Colon & Rectum. 46(3):305-312. https://doi.org/10.1007/s10350-004-6546-9

119. Mecklin J, Järvinen H. 1993. Treatment and follow-up strategies in hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Diseases of the Colon & Rectum. 36(10):927-929. https://doi.org/10.1007/bf02050627

120. Lynch HT, Watson P, Shaw TG, Lynch JF, Harty AE, Franklin BA. 1999. Clinical impact of molecular genetic diagnosis, genetic counceling, and management of hereditary cancer. Cancer. 862457-2463.

121. Boland CR, Sato J, Saito K, Carethers JM, Marra G, Laghi L, Chauhan. 1998. Genetic Instability and Chromosomal Aberrations in Colorectal Cancer: A Review of the Current Models. Cancer Detect Prev. 22(5):377-382. https://doi.org/10.1046/j.1525-1500.1998.00050.x

122. Reyes CM, Allen BA, Terdiman JP, Wilson LS. 2002. Comparison of selection strategies for genetic testing of patients with hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Cancer. 95(9):1848-1856. https://doi.org/10.1002/cncr.10910

123. Giardiello FM, Brensinger JD, Peterson GM. 2001. AGA technical review on hereditary colorectal cancer and genetic testing. Gastroenterology. 121(1):198-213. https://doi.org/10.1053/gast.2001.25581

124. Christensen M, Katballe N, Wikman F, Primdahl H, Sørensen FB, Laurberg S, Ørntoft TF. 2002. Antibody-based screening for hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma compared with microsatellite analysis and sequencing. Cancer. 95(11):2422-2430. https://doi.org/10.1002/cncr.10979

125. Salovaara R, Loukola A, Kristo P, Kääriäinen H, Ahtola H, Eskelinen M, Härkönen N, Julkunen R, Kangas E, Ojala S, et al. 2000. Population-Based Molecular Detection of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. JCO. 18(11):2193-2200. https://doi.org/10.1200/jco.2000.18.11.2193

126. Salahshor S, Koelble K, Rubio C, Lindblom A. 2001. Microsatellite Instability and hMLH1 and hMSH2 Expression Analysis in Familial and Sporadic Colorectal Cancer. Lab Invest. 81(4):535-541. https://doi.org/10.1038/labinvest.3780262

127. Lanspa SJ, Lynch HT, Smyrk TC, Strayhorn P, Watson P, Lynch JF, Jenkins JX, Appelman HD. 1990. Colorectal Adenomas in the Lynch Syndromes. Gastroenterology. 98(5):1117-1122. https://doi.org/10.1016/0016-5085(90)90323-s

128. Jass JR. 1995. Colorectal Adenoma Progression and Genetic Change: Is There a Link?. Annals of Medicine. 27(3):301-306. https://doi.org/10.3109/07853899509002581

129. Annie Yu H, Lin KM, Ota DM, Lynch HT. 2003. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: preventive management. Cancer Treatment Reviews. 29(6):461-470. https://doi.org/10.1016/s0305-7372(03)00084-7

130. de Vos tot Nederveen Cappel WH. 2003. Decision analysis in the surgical treatment of colorectal cancer due to a mismatch repair gene defect. Gut. 52(12):1752-1755. https://doi.org/10.1136/gut.52.12.1752

131. Rodríguez-Bigas MA, Vasen HF, Pekka-Mecklin J, Myrhøj T, Rozen P, Bertario L, Järvinen# HJ, Jass JR, Kunitomo K, Nomizu T, et al. 1997. Rectal Cancer Risk in Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer After Abdominal Colectomy. Annals of Surgery. 225(2):202-207. https://doi.org/10.1097/00000658-199702000-00008

132. Box JC, Rodriguez-Bigas MA, Weber TK, Petrelli NJ. 1999. Clinical implications of multiple colorectal carcinomas in hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma. Diseases of the Colon & Rectum. 42(6):717-721. https://doi.org/10.1007/bf02236924

133. Dove-Edwin I, Boks D, Goff S, Kenter GG, Carpenter R, Vasen HFA, Thomas HJW. 2002. The outcome of endometrial carcinoma surveillance by ultrasound scan in women at risk of hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma and familial colorectal carcinoma. Cancer. 94(6):1708-1712. https://doi.org/10.1002/cncr.10380

134. Mecklin J, Järvinen HJ. 1986. Clinical features of colorectal carcinoma in cancer family syndrome. Diseases of the Colon & Rectum. 29(3):160-164. https://doi.org/10.1007/bf02555012

135. Lynch HT, Albano W, Recerbaren J, Lynch PM, Lynch JF, Elston R. 1981. Prolonged survival as a component of hereditary breast and nonpolyposis colon cancer. Medical Hypotheses. 7(9):1201-1209. https://doi.org/10.1016/0306-9877(81)90063-3

136. Sankila R, Aaltonen L, Jarvinen H, Mecklin J. 1996. Better survival rates in patients with MLH1-associated hereditary colorectal cancer. Gastroenterology. 110(3):682-687. https://doi.org/10.1053/gast.1996.v110.pm8608876

137. Watson P, Lin KM, Rodriguez-Bigas MA, Smyrk T, Lemon S, Shashidharan M. 1998. Colorectal carcinoma survival among hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma family members. Cancer. 83259-266.

138. NCI: Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program. [Internet]. National Institute of Health.[cited 16 Sep 2020]. Available from: https://seer.cancer.gov/

139. Gryfe R, Kim H, Hsieh ET, Aronson MD, Holowaty EJ, Bull SB, Redston M, Gallinger S. 2000. Tumor Microsatellite Instability and Clinical Outcome in Young Patients with Colorectal Cancer. N Engl J Med. 342(2):69-77. https://doi.org/10.1056/nejm200001133420201

140. Ramsey SD. 2001. Cost-Effectiveness of Microsatellite Instability Screening as a Method for Detecting Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Ann Intern Med. 135(8_Part_1):577. https://doi.org/10.7326/0003-4819-135-8_part_1-200110160-00008

141. Shibata D, Peinado MA, lonov Y, Malkhosyan S, Perucho M. 1994. Genomic instability in repeated sequences is an early somatic event in colorectal tumorigenesis that persists after transformation. Nat Genet. 6(3):273-281. https://doi.org/10.1038/ng0394-273

142. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. 1993. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature. 363(6429):558-561. https://doi.org/10.1038/363558a0

143. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J, Woffendin H, Garnett MJ, Bottomley W, et al. 2002. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417(6892):949-954. https://doi.org/10.1038/nature00766

144. Lynch HT, Smyrk TC. 1998. Identifying Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. N Engl J Med. 338(21):1537-1538. https://doi.org/10.1056/nejm199805213382109