裂解和蛋白提取

当纯化蛋白用于功能或结构研究，或用于制备处理和生产时，首先要做的是破坏细胞或组织从而获取其中的目标蛋白。细胞裂解和蛋白质溶解是进行有效分析和高效处理的关键步骤。提取方法包括酶法、化学法、机械法或几种方法的联合使用。

• 基于去污剂的裂解法
• 冻融裂解法
• 渗透压冲击法
• 超声波破碎法
• 机械方法
• 酶解法

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许多方法可用于破坏细胞、制备​​其内含物进行分析。通常，当样品由易于裂解的培养细胞或血细胞组成时，采用温和的方法；如要破坏更坚固的细菌或植物细胞，或嵌入结缔组织的哺乳动物细胞，则采用更有力的方法。

• 表面活性剂溶解法：基于去污剂的裂解：去污剂裂解是一种比较温和的方法，适用于哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母和植物。细胞悬浮液轻轻离心后重悬于含有去污剂的裂解液中，去污剂可用于破坏细胞膜。溶解细胞膜，裂解细胞并释放其内容物。若去污剂会干扰分析或生产，需在下游处理时除去去污剂。
• 冻融裂解法：本方法适用于哺乳动物或细菌细胞悬浮液。用液氮快速冷冻细胞悬浮液。然后将样品解冻，用移液管或在裂解缓冲液中温和涡旋将其重悬，重复此过程数次。在循环之间，将样品离心，保留含有可溶蛋白的上清液。
• 渗透压休克法：这是一种非常温和的方法，可以在不使用表面活性剂的情况下裂解悬浮的哺乳动物或细菌细胞。本方法通常与机械破碎技术结合，依赖于从高渗透性介质到低渗透性介质的变化，非常适合于后续将裂解物分馏成亚细胞组分的应用。
• 超声破碎法：这种蛋白质提取方法最常用于细胞悬浮液。通过插入样品中的探针，细胞被高频声波破坏。声波产生低压区域，导致细胞膜破裂。
• 机械破碎技术：可以使用各种粗略但有效的“破碎和研磨”措施从细胞和组织中提取蛋白。例如，可以使用Dounce或Potter-Elvehjem匀浆法运用液体剪切力破坏细胞膜。使用Waring搅拌器或Polytron®匀浆器在冷却的缓冲液中切碎或碾碎组织，将组织均质化。在液氮中冷冻组织或细胞，加入氧化铝或沙子用研钵和研杵一起研磨成细粉。快速搅动细胞和小玻璃珠会破坏细胞壁，对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效。
• 酶解法：酶解法从夹杂在纤维组织中的细菌，酵母或真核细胞中提取蛋白质时，经常使用酶促方法，在这些组织中，细胞膜被坚固的保护结构所包围。溶菌酶(Lysozyme)、变溶菌素(Mutanolysin)、MetaPolyzyme六酶混合物、Lysonase和链霉蛋白酶(Pronase)等细胞裂解酶或混合液可联合组织消化酶(即胶原酶、软骨素酶、透明质酸酶），用于溶解或破坏单独的机械方法无法轻易裂解的细胞壁、外壳、荚膜、衣壳等结构。酶解之后，通常在裂解缓冲液中进行均质化、超声处理或剧烈涡旋处理。

此外，由于细胞破裂后释放内源性蛋白酶和磷酸酶并降解靶蛋白，因此应在细胞破裂期间和随后的纯化过程中，使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂保护样品，避免靶蛋白不受控制地损失。