C9891

Collagenase aus Clostridium histolyticum

Type IA, 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid, ≥125 CDU/mg solid, For general use

• Synonym(e): Clostridiopeptidase A
• CAS-Nummer: 9001-12-1
• EC-Nummer: 3.4.24.3 (BRENDA, IUBMB)
• EG-Nummer: 232-582-9
• MDL-Nummer: MFCD00130830
• UNSPSC-Code: 12352204
• NACRES: NA.54

Eigenschaften

• Qualitätsniveau: 200
• Form: essentially salt-free, lyophilized powder
• Spezifische Aktivität: ≥125 CDU/mg solid; 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid
• Mol-Gew.: 68-130 kDa
• Methode(n): cell culture | mammalian: suitable; single cell analysis: suitable
• Löslichkeit: TESCA buffer (50 mM TES, 0.36 mM Calcium chloride, pH 7.4): soluble
• Anwendung(en): diagnostic assay manufacturing
• Versandbedingung: wet ice
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Anwendung

Das Enzym wird außerdem zusammen mit anderen Proteasen zur Disaggregation von menschlichem Tumorgewebe, Mäusenieren, menschlichem Hirngewebe und Lungenepithelgewebe verwendet. Es ist ebenfalls bei Leber- und Nierenperfusionsstudien, beim Pankreasverdau, bei der Isolierung von nicht-parenchymalen Rattenleberzellen und Hepatozyten nützlich. Das Enzym von Sigma wurde für den Verdau von Typ-I-Kollagen aus bovinen trabekulären und kortikalen Knochen verwendet. Es wird außerdem als Positivkontrolle bei FALGPA-Assays auf Streptococci-Zellen der Gruppe B verwendet.

Geeignet zur Verwendung bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen für die Sequenzierung.

Biochem./physiol. Wirkung

Collagenase wird durch vier Grammatom Calcium pro Mol Enzym aktiviert. Sie wird durch Ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylether)-N, N, N′,N′-tetraessigsäure, β-Mercaptoethanol, Glutathion, Thioglycolsäure und 8-Hydroxychinolin gehemmt.

Eine wirkungsvolle Abgabe von Zellen aus dem Gewebe erfordert die Wirkung von sowohl Collagenase-Enzymen als auch der neutralen Protease. Collagenase wird durch vier Grammatom Calcium (Ca²⁺) pro Mol Enzym aktiviert. Es wird davon ausgegangen, dass das Kulturfiltrat mindestens 7 verschiedene Proteasen mit einem Molekulargewicht von 68 - 130 kDa enthält. Der optimale pH-Wert beträgt 6,3 - 8,8. Das Enzym wird üblicherweise zum Verdau von Bindegewebskomponenten in Gewebeproben verwendet, um einzelne Zellen freizusetzen. Die Collagenase-Behandlung kann dazu führen, dass einige Zellen absterben. Üblicherweise werden Konzentrationen zwischen 0,1 und 5 mg/ml für den Verdau verwendet. Die Dauer der Reaktion variiert zwischen 15 Minuten und mehreren Stunden für eine zufriedenstellende Effizienz der Zelldissoziation, ohne zu viele Zellen absterben zu lassen. Krebs-Ringer-Puffer mit Calcium und BSA wird bevorzugt und Zn²⁺ wird für die Aktivität benötigt. Das Enzym erkennt die Sequenz -R-Pro-8-X-Gly-Pro-R-, wobei X meistens eine neutrale Aminosäure repräsentiert. Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA)4; β-Mercaptoethanol; Glutathion (reduziert); Thioglycolsäure, Natrium; 2,2′-Dipyridyl; 8-Hydroxyquinolin, Cystein hemmen bekannterweise die Enzymaktivität.

Vorsicht

Bei Lieferung ist dieses Produkt für die Dauer von einem Jahr bei -20 °C haltbar. Es kommt innerhalb von 30 Tagen bei 37 °C, 50 °C und -20 °C zu keinem Verlust bei der FALGPA- oder Proteaseaktivität. Lösungen von Rohcollagenase sind stabil, wenn sie schnell in Aliquoten (10 mg/ml) eingefroren und bei -20 °C tiefgekühlt gelagert werden. Weitere Gefrier-/Auftauzyklen schädigen die Lösung. Das Produkt behält seine gesamte Aktivität über 7 Stunden, wenn es auf Eis aufbewahrt wird.

Einheitendefinition

Eine Collagen-Aufschlusseinheit (Collagen Digestion Unit, CDU) setzt Peptide aus Rinder-Achillessehnencollagen entsprechend der Ninhydrin-Anfärbung von 1,0 μmol Leucin in 5 Stunden bei pH 7,4 und 37 °C in Gegenwart von Calciumionen frei. Eine FALGPA-Hydrolyseeinheit hydrolysiert 1,0 μmol Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala pro Minute bei 25 °C. Eine neutrale Protease-Einheit hydrolysiert die Caseinmenge, die eine Färbung entsprechend 1,0 μmol Tyrosin pro 5 Stunden bei pH 7,5 und 37 °C produziert. Eine Clostripain-Einheit hydrolysiert 1,0 μmol BAEE pro Minute bei pH 7,6 und 25 °C in Gegenwart von DTT.

Angaben zur Herstellung

Dieses Produkt entspricht der ersten 40%igen Ammoniumsulfat-Fraktion von Mandl, I., et al., J. Clin. Invest., 32, 1323 (1953). Lösungen werden üblicherweise mit 1-2 mg/ml in TESCA-Puffer hergestellt (enthält 50 mM TES, 0,36 mM Calciumchlorid, pH-Wert 7,4 bei 37 °C).

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS08,GHS07
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H315,H319,H334,H335
• P-Sätze: P261 - P264 - P271 - P280 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338
• Gefahreneinstufungen: Eye Irrit. 2 - Resp. Sens. 1 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
• Zielorgane: Respiratory system
• Lagerklassenschlüssel: 11 - Combustible Solids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): Not applicable
• Flammpunkt (°C): Not applicable
• Persönliche Schutzausrüstung: dust mask type N95 (US), Eyeshields, Faceshields, Gloves