Sequenziamento
La capacità di determinare la composizione e la sequenza degli acidi nucleici in un filamento di DNA o RNA ha profonde implicazioni negli studi di genetica moderna e in numerosi altri campi essenziali per la ricerca sulle malattie e per una migliore comprensione dei diversi organismi. La possibilità di sequenziare gli acidi nucleici non solo è utile per decifrare il codice genetico di un organismo, ma anche rappresenta un potente strumento per manipolare, in combinazione con altre tecniche molecolari, la sequenza del DNA e verificarne i cambiamenti attraverso il sequenziamento. Poiché il DNA codificante funge da informazione in codice per la sintesi delle proteine, i ricercatori sono ora in grado di progettare proteinericombinanti personalizzate, che contengono una grande varietà di elementi funzionali e sono ampiamente utilizzate per rispondere ad un elevato numero di importanti quesiti scientifici. Per ulteriori reagenti e indicazioni sul sequenziamento del genoma, visita la nostra risorsa sequenziamento di nuova generazione
Sequenziamento con metodo Sanger
Inizialmente la composizione degli acidi nucleici veniva determinata usando metodi di chimica analitica. Fred Sanger e colleghi cominciarono a mettere a punto delle metodiche - inizialmente basate su frammenti digeriti radiomarcati e frazionamento bidimensionale - per fornire alcune delle prime sequenze di acidi nucleici complete. I progressi nel settore sono andati avanti per diversi decenni, alimentando la creazione di una libreria sempre più vasta di proteine e genomi sequenziati. Questi miglioramenti includevano la separazione dei nucleotidi in base alla lunghezza, utilizzando l'elettroforesi su gel seguita da elettroforesi capillare. Si sono poi aggiunte l'incorporazione di nucleotidi marcati in modo fluorescente e l'analisi computerizzata automatizzata di ciascun frammento di acido nucleico per ottenere l’attuale metodo di sequenziamento di Sanger.
Metodologia per il sequenziamento del DNA
Sebbene nel tempo i metodi di sequenziamento del DNA siano stati continuamente migliorati, alcuni componenti fondamentali sono necessari ed utilizzati anche nelle piattaforme di sequenziamento moderne. Tipicamente la preparazione del DNA prevede l'isolamento e la purificazione del DNA dall’organismo ospite. Ulteriori componenti necessari, tra cui le basi di DNA, i primer, le basi modificate con tag fluorescenti (nucleotidi terminatori) e la DNA polimerasi, vengono uniti in un unica provetta. La provetta contenente i vari reagenti è quindi sottoposta ad una serie di fasi di riscaldamento e raffreddamento che produrrà una libreria di corte sequenze di DNA, che ricalcano la sequenza completa del DNA di interesse, ciascuna terminante con un nucleotide terminatore marcato in modo fluorescente. I nuovi frammenti di DNA contenenti i nucleotidi con marcatura fluorescente vengono quindi separati in base alla lunghezza, fatti passare attraverso un capillare e disposti in base alle dimensioni. Si utilizza quindi un laser che eccita la base fluorescente presente in ciascun filamento ed il segnale viene acquisito da un rilevatore. Infine si usa un’analisi al computer che consente di assemblare le informazioni raccolte in una sequenza di DNA completa.
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