Sequenziamento di nuova generazione
Il termine NGS (sequenziamento di nuova generazione) comprende diverse tecnologie correlate che consentono la copertura, tramite sequenziamento massivo parallelo o sequenziamento profondo, di una specifica regione del genoma o dell'intero genoma di un dato organismo. Essenziali per i settori di ricerca che si basano sulla genomica, le tecnologie di sequenziamento esistono già da decenni. Oggi, grazie ai continui progressi delle tecnologie NGS o sequenziamento massivo parallelo di DNA e RNA, i ricercatori hanno raggiunto una maggiore copertura del genoma e posseggono gli strumenti necessari all’analisi dei dati, a costi sempre più ridotti. Le tecnologie NGS sono usate in applicazioni che vanno oltre la semplice analisi del genoma in quando implicate nei recenti sviluppi della genomica funzionale e della ricerca sulle malattie.
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Panoramica sulle metodiche NGS
La metodologia e i reagenti per NGS sono in continua evoluzione e sono ora disponibili numerosi sistemi NGS. Le piattaforme comunemente utilizzate prevedono diversi passaggi critici nel flusso di lavoro NGS, tra cui la preparazione del campione o della libreria, la generazione dei cluster, il sequenziamento e l'analisi dei dati. La preparazione del campione in genere comporta l'amplificazione del DNA o l'aggiunta di linker di sequenza o adattatori. La generazione di un cluster per ciascuna sequenza di DNA avviene quando il DNA contenente il linker legato in modo covalente si ibrida su una superficie solida per l'amplificazione a ponte mediante PCR o con metodi alternativi come la PCR in emulsione. Inoltre, esistono molti metodi di sequenziamento del DNA, tra cui sequenziamento mediante ligazione, sequenziamento mediante sintesi, pirosequenziamento e sequenziamento basato su semiconduttore ionico. Ciascun metodo di sequenziamento comporta fasi di reazione e chimiche diverse che determinano la lunghezza di ciascuna sequenza (lunghezza delle reads), il tasso di errore e il costo dei reagenti.
Approcci analitici per l'analisi dei dati NGS
Un elemento finale per tutti i flussi di lavoro NGS è la fase interpretazione dei dati, dopo il sequenziamento. Ogni piattaforma e flusso di lavoro NGS produce un'enorme quantità di informazioni digitali acquisite dai computer, il set di dati grezzi viene quindi analizzato dai bioinformatici che si avvalgono di un numero sempre crescente di strumenti analitici per l'allineamento e la mappatura della reads, come Bowtie, Galaxy e molti altri. Molti degli sviluppi nel campo delle tecnologie NGS derivano dalla convergenza di diversi settori scientifici che ha consentito di sviluppare e ottimizzare l'analisi e l'interpretazione di un così vasto insieme di dati. A seconda delle specifiche esigenze applicative, i ricercatori sono ora in grado di utilizzare questi potenti strumenti per sequenziare interi genomi, esomi o trascrittomi per la di ricerca di base e per gli studi sulle malattie.
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