SEQRI

SEQPLEX-I WTA Kit

Whole Transcriptome Amplification, RNA Amplification

• Synonym(e): RNA amplification kit
• UNSPSC-Code: 41121800
• NACRES: NA.55

Eigenschaften

• Methode(n): whole genome amplification: suitable; whole transcriptome amplification: suitable
• Kompatibilität: Illumina (Next Generationa Sequencing)
• Versandbedingung: wet ice
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Das SeqPlex^™-I Kit für die Gesamt-Transkriptom-Amplifikation (GTA) ermöglicht die Amplifikation von kleinen Mengen revers transkribierter RNA oder degradierter RNA für den direkten Input in Illumina^®-Next-Generation-Sequencing-(NGS-)Durchflusszellen. Der SeqPlex-i-Prozess besteht aus drei Schritten:
Prä-Amplifikation/Bibliothek-Synthese: Im Schritt der Prä-Amplifikation/Bibliothek-Synthese unter Verwendung der (Reagenzien zur Bibliothekserstellung) wird die Matrizen-RNA mithilfe von Primern, die aus einem semi-degenerierten 3′-Ende und universellen 5′-Enden bestehen, revers transkribiert. Im weiteren Verlauf der Polymerisation dienen verdrängte und durch RNase H erzeugte Einzelstränge als neue Matrizen für weitere Primerhybridisierung und weitere Elongation, durch die zufällige, überlappende cDNAs entstehen, die von einem universellen Primer (5′) und einer Primer-Komplement-Sequenz (3′) flankiert werden.

Amplifikation 1: Bei der Synthese der Amplifikationsbibliothek (mithilfe der Reagenzien für die Amplifikation 1) werden Produkte aus der Prä-Amplifikation/Bibliothek-Synthese mittels Einzelprimer-PCR über die Sequenz am universellen Ende amplifiziert. Diese Amplifikationsprodukte haben üblicherweise 200 bis über 500 Basenpaare. Hinweis: Amplikons aus degradierter RNA (z. B. Formalin-fixiert Paraffin-eingebettet, FFPE), sind normalerweise kürzer und abhängig von der Länge der Start-RNA.

Amplifikation 2: Bei der Synthese der Sequenzierungsbibliothek (mithilfe der Reagenzien für die Amplifikation 2) werden Einzelprimer-Amplikons aus der Amplifikation 1 in duale Illumina^®-Primer-PCR-Produkte umgewandelt, die bereit für die Aufreinigung, Quantifizierung und Illumina^®-NGS sind.

Um SeqPlexI-Adapter in Röhrchen zu bestellen, laden Sie bitte NGSO Adapters SeqPlexI tubes (XLSX File) herunter. Um Arrayed-Adapter in Platten zu bestellen, laden Sie bitte NGSO Plate SeqPlexI arrayed plates (XLSX File) herunter. Einzelheiten zu unseren maßgeschneiderten Adapterprodukten, Next-Gen Sequencing Oligos (NGSO), finden Sie unter SigmaAldrich.com/nextgenoligos. Von dieser Seite aus können Sie direkt auf einen Online-Bestellkonfigurator zugreifen, indem Sie „Order Now“ anklicken. Beide Datentabellen können direkt hochgeladen werden, nachdem Sie die Menge und/oder das Format aus den Drop-Down-Menüs ausgewählt haben. Für Adapter in Lösung in Röhrchen oder in Platten ist nur die Option „NGSO-Silver“ verfügbar, die eine Längenausschlussgrenze von 60 Basen hat (einige der Adapter sind länger als 60 Basen). Ferner können Adapter in Platten nicht in Duplex-Konfiguration vorliegen. Wenn Sie eine Machbarkeitsbewertung für eine Bestellung von NGSO-Silver mit mehr als 60 Basen oder in Duplex-Konfiguration in Platten wünschen, senden Sie bitte eine entsprechende Anforderung an dnaoligos@milliporesigma.com. Alle Adapter sind durch Online-Bestellung leicht erhältlich, wenn sie trocken und in Röhrchen entweder als NGSO-Bronze oder -Gold (empfohlene Aufreinigung für jeden Adapter) vorliegen.

Anwendung

Das SeqPlex^™-I WTA-Kit wird zur Amplifikation des Gesamttranskriptoms verwendet. Es wird auch zur Sequenzierung der Gesamtnukleinsäure aus Chikungunya-Virus(CHIKV)-Zellkulturproben, die positiv für den cytopathischen Effekt (CPE) sind.

Leistungsmerkmale und Vorteile

• Amplifiziert fragmentierte/extrem kleine Mengen der Gesamt-RNA: Fragmentierte oder intakte RNA jeglicher Herkunft einschließlich FFPE und RIP werden problemlos mittels Random-Priming-Technologie amplifiziert.
• Semi-degeneriertes Library-Primer-Design für eine vollständigere Transkriptomabdeckung und effizientes Priming
• Weniger Arbeitsschritte: cDNA-Fragmentierung vor der Sequenzierung entfällt
• Hohe Effizienz: ds-cDNA-Amplifikation innerhalb von maximal 8 Stunden
• Kosteneffizient: Kein zusätzlicher Schritt zur Erstellung der NGS-Bibliothek erforderlich
• Kompatibel mit Illumina^® Next Generation Sequencing

Sonstige Hinweise

1) Umgang mit RNA
a) Die Reagenzien in diesem Kit wurden getestet, um sicherzustellen, dass keine RNasen vorhanden sind.
b) Der Anwender muss jedoch die Integrität der Versuchsergebnisse durch das Tragen grundlegender Schutzausrüstungen sicherstellen, zu denen Handschuhe und Laborkittel gehören.
c) Alle Transfers von Reagenzien im Rahmen dieses Prozesses sollten unter einer Laminar-Flow-Haube oder in einem dafür vorgesehenen Reinraum durchgeführt werden.
d) Gefrorene RNA-Proben sollten auf Eis aufgetaut werden.

2) Eine 20-μL-Reaktion im Amplifikationsschritt 2 ergibt >100 ng amplifizierter doppelsträngiger cDNA, wenn man mit 100 pg bis 5 ng qualitativ hochwertiger RNA startet. Höhere Ausgangsmengen und eine höhere Qualität des RNA-Templates führen in der Regel zu einer verbesserten Ausbeute. Bei beschädigter RNA, z. B. aus FFPE, werden 1–50 ng RNA als Ausgangsmenge empfohlen.

3) Die in diesem Kit enthaltenen Dual-Index-Adapterprimer (AP100) können nur für eine Probe verwendet werden. Wenn für die Sequenzierung ein Pooling von Proben erforderlich ist, muss der Anwender zusätzliche Index-Primer-Sets verwenden. Siehe Beispiel zu Index-Primer-Sequenzen auf Seite 2 des technischen Merkblatts.

Rechtliche Hinweise

Illumina is a registered trademark of Illumina, Inc.

SeqPlex is a trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC

Haftungsausschluss

Das SeqPlex-I DNA Amplification Kit zur Amplifikation des Gesamtgenoms (Whole Genome Amplification, WGA) ist nur für die Forschung und Entwicklung vorgesehen. Nicht für den Arzneimittel-, Haushalts- oder sonstigen Gebrauch vorgesehen.

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS08
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H334
• P-Sätze: P261 - P284 - P501
• Gefahreneinstufungen: Resp. Sens. 1
• Lagerklassenschlüssel: 10 - Combustible liquids