RTT-RO

Terminale Transferase

from Calf Thymus, recombinant, E. coli

• EC-Nummer: 2.7.7.31 (BRENDA, IUBMB)
• UNSPSC-Code: 12352204
• NACRES: NA.21

Eigenschaften

• Rekombinant: expressed in E. coli
• Qualitätsniveau: 100
• Form: solution
• Verwendung: sufficient for 20 reactions (03333566001); sufficient for 60 reactions (03333574001)
• Verpackung: pkg of 24,000 U (03333574001 [400 U per reaction]); pkg of 8,000 U (03333566001 [400 U per reaction])
• Hersteller/Markenname: Roche
• Anwendung(en): genomic analysis
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Terminale Transferase katalysiert die Template-unabhängige Zugabe von Desoxy- und Didesoxy-Nukleotidtriphosphaten zu den 3′-OH-Enden der doppel- oder einsträngigen DNA und zu Oligonukleotiden. Terminale Transferase baut Digoxigenin-, Biotin- und Fluorochrom-markierte Desoxy- und Didesoxy-Nukleotidtriphosphate sowie radioaktiv markierte Desoxy- und Didesoxy-Nukleotidtriphosphate ein. Der mitgelieferte 5-fach konzentrierte Reaktionspuffer gestattet ein optimales Tailing bei allen Arten doppelsträngiger DNA-Enden: glatte Enden, Enden mit 3′-Überstand oder Enden mit 5′-Überstand. Die höchsten Einbauraten werden mit 3′-überstehenden Enden erzielt.

Anwendung

Terminale Transferase kann verwendet werden, um den 3′-OH-Enden von doppel- oder einsträngigen DNA-Fragmenten Nukleotide hinzuzufügen, zum Beispiel:

• Tailing mit dNTPs:Hinzufügen eines homopolymeren Schwanzes zu DNA-Fragmenten
• Markierung von doppel- und einsträngiger DNA und Oligonukleotiden mit radioaktiv oder chemisch modifizierten Nukleotiden (z. B. DIG-dUTP)

Markierung des 3′-Endes mit ddNTPs:
Markierung von doppel- und einsträngiger DNA und Oligonukleotiden mit radioaktiv oder chemisch modifizierten Dideoxynukleotiden (z. B. DIG-ddUTP)

Leistungsmerkmale und Vorteile

Einbau von markierten oder modifizierten Nukleotiden
Zusätzlich zu den Standardnukleotiden fügt terminale Transferase der DNA auch radioaktive oder modifizierte (z. B. Digoxigenin-, Biotin- oder Fluorochrom-markierte) dNTPs oder ddNTPs hinzu.

Verpackung

1 Kit mit 3 Komponenten

Qualität

Nach Tests gemäß den aktuellen Qualitätskontrollverfahren frei von 5′- und 3′-Exonukleasen, Endonukleasen und Nicking-Aktivitäten.

Prinzip

Oligonukleotide werden mittels terminaler Transferase an ihrem 3′-Ende enzymatisch markiert; dabei wird ein einziges, Digoxigenin-markiertes Didesoxyuridin-triphosphat eingebaut. Alternativ können Oligonukleotide auch durch Hinzufügen eines längeren Nukleotid-Schwanzes markiert werden. Für die Erzeugung von Oligunukleotidsonden mit Schwanz werden Desoxynukleotid-Triphosphate in einer Template-unabhängigen Reaktion verwendet.

Einheitendefinition

Eine Einheit ist die Enzymaktivität, die bei +37 °C innerhalb von 30 Minuten unter Assaybedingungen 1 nMol dTMP in säureunlösliche Produkte einbaut, wobei d(pT)₆ als Primer dient. Einheiten-Assaybedingungen: 200 mM Kaliumcacodylat, 1 mM CoCl₂, 1 mM dTTP, 0,1 OD d(pT)₆, 6,25 pmol ³H dTTP in einem 120-μl-Reaktionsvolumen.

Einheitengehalt: Einheiten-Assaybedingungen: 200 mM Kaliumcacodylat, 1 mM CoCl₂, 1 mM dTTP, 0,1 OD d(pT)₆, 6,25 pmol ³H dTTP in einem 120-μl-Reaktionsvolumen.

Volumenaktivität: 400 U/μl

Probenmaterialien

• Doppel- oder einsträngige DNA-Fragmente
• Doppel- oder einsträngige Oligonukleotide

Angaben zur Herstellung

Arbeitslösung: Standardmäßige Tailing-Reaktion mit radioaktiven Nukleotiden
Zubereitung einer CoCl₂-Arbeitslösung
10 μl doppelt destilliertes Wasser und 15 μl der mitgelieferten 25-mM-CoCl₂-Lösung in ein steriles Fläschchen geben: Endkonzentration: 15 mM

Zubereitung einer radioaktiven Markierungsmischung
dATP- und dTTP-Markierungsmischung: 1 Volumen einer 2,5 mM starken dATP- oder dTTP-Lösung mit 15 Volumen doppelt destilliertem Wasser und 4 Volumen α-³²P-dATP oder α-³²P-dTTP (800 Ci/mmol, ca. 30 TBq/mmol) mischen.
dGTP- und dCTP-Markierungsmischung: 1 Volumen einer 2 mM starken dGTP- oder dCTP-Lösung mit 15 Volumen doppelt destilliertem Wasser und 4 Volumen α-³²P-dGTP oder α-³²P-dCTP (800 Ci/mmol, ca. 30 TBq/mmol) mischen

Sonstige Hinweise

Für den allgemeinen Laborgebrauch. Doppelstrangige DNA kann entweder glatte, 3′-überstehende oder 5′-überstehende Enden haben. 3′-überstehende Enden resultieren jedoch in den höchsten Inkorporationsraten. TdT benötigt ein mindestens drei Basen umfassendes Oligonukleotid als Primer, und das Tailing ist bei einsträngiger DNA effizienter als bei doppelstrangiger.

Nur Kit-Komponenten

• Terminal Transferase 400 U/μl
• TdT Reaction Buffer 5x concentrated
• CoCl₂ Solution 25 mM

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS07,GHS08,GHS09
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H302 + H332 - H350i - H360F - H411
• P-Sätze: P201 - P261 - P273 - P280 - P308 + P313 - P391
• Gefahreneinstufungen: Acute Tox. 4 Inhalation - Acute Tox. 4 Oral - Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B Inhalation - Repr. 1B
• Lagerklassenschlüssel: 6.1D - Non-combustible, acute toxic Cat.3 / toxic hazardous materials or hazardous materials causing chronic effects
• WGK: WGK 3
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash