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High Pure RNA-Gewebekit

sufficient for 50 isolation(s), suitable for RT-PCR, suitable for Northern blotting

• Synonym(e): RNA-Aufreinigung
• UNSPSC-Code: 41105500

Eigenschaften

• Verwendung: sufficient for 50 isolation(s)
• Qualitätsniveau: 100
• Hersteller/Markenname: Roche
• Verpackung: kit of for 50 isolations
• Methode(n): Northern blotting: suitable; RT-PCR: suitable

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Das High Pure RNA-Gewebekit ist für die Aufreinigung der intakten Gesamt-RNA aus Gewebeproben ohne kontaminierende DNA vorgesehen. Isolierung von RNA bei geringem bis mittlerem Durchsatz. Nukleinsäuren binden in Gegenwart von chaotropen Salzen (Guanidin-HCl) an die Oberfläche des Glasfaservlieses. Das ermöglicht dem High Pure-Filterröhrchen eine spezifische Immobilisierung von Nukleinsäuren (sowohl DNA als auch RNA), während diese von Verunreinigungen befreit werden. Für die RNA-Isolierung können die Bindungsbedingungen optimiert werden, um die Immobilisierung der gesamten RNA sicherzustellen. Das hochreine RNA-Isolationskit kann intakte Gesamt-RNA schnell aus einem breiten Spektrum von Forschungsprobenmaterial isolieren, einschließlich kultivierte Zellen, Säugetierblut, Leukozyten, Hefe und Bakterien. Es isoliert Gesamt-RNA aus Säugetiergeweben wie Leber, Milz, Lunge und Herz von Mäusen schnell.

Kapazität: Die High Pure Spin Filter-Röhrchen nehmen bis zu 700 μl Probenvolumen auf.
Probenmaterial: Solides Gewebe (z. B. Leber, Milz, Lunge, Herz der Maus): 1–25 mg.

Hinweis: Die Probengröße hängt von der Methode der Probenpräparation ab; größere Proben (> 10 mg) sollten mittels Rotor-Stator-Homogenisierung verarbeitet werden.

Anwendung

Das High Pure RNA-Gewebe-Kit wird wie folgt verwendet:

• zum Extrahieren von Gesamt-RNA aus menschlichen Zellen zum Erstellen einer cDNA-Bibliothek
• zum Extrahieren von Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen für die Echtzeit-PCR-Analyse
• zum Extrahieren von Gesamt-RNA aus dem Hippocampus von Ratten
• zum Aufreinigen von Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen und der menschlichen Wirbelsäule
• zum Isolieren von Gesamt-RNA aus Gewebe der Herzkammerwand

Die isolierte RNA kann in vielen Downstream-Anwendungen eingesetzt werden:

• Northern Blot
• RACE
• Primerverlängerung
• Differenzanzeige
• RNase-Schutzassay
• In-vitro-Translation

Leistungsmerkmale und Vorteile

• Präparation von RNA-Proben in ca. 30 Minuten.
• Erzeugen von konzentrierter RNA, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist.
• Minimierter RNA-Verlust mit einem Kit, das ohne Ausfällung und ohne andere den RNA-Abbau fördernden Handhabungsschritte Verunreinigungen entfernt.
• Es werden auch keine schädlichen organischen Verbindungen wie Cäsiumchlorid, Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid benötigt.

Komponenten

• Lyse-/Bindungspuffer
• DNase I, Lyophilisat
• DNase-Inkubationspuffer
• Waschpuffer I
• Waschpuffer II
• Elutionspuffer
• High-Pure-Spin-Filter-Röhrchen (enthalten Glasfaservlies)
• Sammelröhrchen

Qualität

• Gewebe wird in Lyse-/Bindingspuffer aufgelöst und homogenisiert und wie beschrieben aufgereinigt.
• Die RNA-Ausbeute wird durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt.
• Integrität und Größenverteilung werden anhand des Bandenmusters ribosomaler RNA in einem denaturierenden Agarosegel untersucht.
• 10 μl des RNA-Eluats werden in der Erststrang-Synthese mit M-MuLV als reverser Transkriptase und p(dT)₁₅ als Primer verwendet. In der anschließenden PCR, die mit dem Expand High Fidelity PCR-System und spezifischen Primern für Glycerinaldehyd 3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) durchgeführt wird, wird das erwartete Amplifikationsprodukt von 983 bp.
• Die Abwesenheit kontaminierender DNA wird mit einem PCR-Test ohne vorherige RT-Reaktion geprüft; es entsteht kein Amplifikationsprodukt.

Angaben zur Herstellung

Gewebeproben werden in Gegenwart von chaotropen Salzen (Guanidin-HCl), die RNasen inaktivieren, aufgelöst und homogenisiert. Das Homogenat wird dann in einem High Pure Spin Filter-Röhrchen auf den Glasfaservlies aufgetragen. Unter den in diesem Verfahren verwendeten Pufferbedingungen binden alle Nukleinsäuren an das Glasfaservlies, kontaminierende Substanzen (wie Salze, Proteine und andere zelluläre Kontaminanten) jedoch nicht. Die DNA im Präparat wird direkt auf dem Filter mit DNase I verdaut. Mit den schnellen Wasch- und Schleuderschritten werden die verdauten DNA-Fragmente und andere zelluläre Kontaminanten auf leichte Weise entfernt. Die verbleibende aufgereinigte RNA wird dann in einem kleinen Volumen eines salzarmen Puffers eluiert.

Sonstige Hinweise

High-Pure-Technologie und Kieselsäure-Adsorptions-Kits
Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren geeignet.

Abbildung 1: Vergleich unterschiedlicher Homogenisierungsverfahren. Mäuseleber wurde mit verschiedenen Verfahren homogenisiert. Aus jedem dieser Homogenate wurde mit dem High Pure RNA-Gewebekit die Gesamt-RNA aufgereinigt. Aliquote der isolierten RNA wurden mit für eine Region der GADH mRNA spezifischen Primern revers transkribiert. Die cDNA-Produkte wurden mittels Gel-Elektrophorese analysiert.

Spur 1: Homogenisierung: Ultra Turrax; Ausbeute: 1,9 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 2: Homogenisierung: Einweg-Kunststoffpistill mit Motorantrieb; Ausbeute: 3 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 3: Homogenisierung: Mörser und Pistill, 20-G-Nadel; Ausbeute: 1,5 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 4: Homogenisierung: Einweg-Kunststoffpistill für die manuelle Anwendung, 20-G-Nadel; Ausbeute: 1,8 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 5: Homogenisierung: Einweg-Kunststoffpistill für die manuelle Anwendung; Ausbeute: 3,4 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 6: Homogenisierung: Bead-Vortex; Ausbeute: 3 μg/mg Gewebe; A 260 / A 280: 2,0
Spur 7: Molekulargewichtsmarker

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS07,GHS08
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H302 + H332,H315,H317,H319,H334
• P-Sätze: P261 - P264 - P280 - P284 - P304 + P340 + P312 - P342 + P311
• Gefahreneinstufungen: Acute Tox. 4 - Acute Tox. 4 Oral - Eye Irrit. 2 - Resp. Sens. 1 - Skin Irrit. 2 Inhalation - Skin Sens. 1
• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash