Analyses par western blot
Le western blotting est une technique reconnue de détection, d'analyse et de quantification des protéines. Cette méthode est largement utilisée pour détecter des molécules protéiques spécifiques dans des échantillons complexes tels que les homogénats de tissus et les lysats cellulaires. La technique de western blot consiste généralement à séparer les protéines par électrophorèse sur gel, puis à les transférer sur une membrane en poly(fluorure de vinylidène) (PVDF) ou en nitrocellulose. Après avoir été transférées, les protéines peuvent être colorées pour être visualisées et directement identifiées par séquençage N-terminal, spectrométrie de masse ou immunodétection.
Dans l'immunodétection par western blot, les protéines sont identifiées par leur liaison à des anticorps spécifiques. En général, un anticorps primaire est utilisé en combinaison avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort ou à la phosphatase alcaline en vue d'une détection par chimioluminescence ou par colorimétrie à l'aide d'un substrat approprié. Un anticorps primaire ou secondaire marqué par fluorescence peut également être utilisé pour une visualisation directe.
La technique de western blot est largement utilisée en biochimie pour détecter la présence de protéines spécifiques, pour déterminer l'ampleur des modifications post-traductionnelles, pour vérifier l'expression des protéines dans les applications de clonage, pour analyser le niveau d'expression des protéines et des biomarqueurs, dans la cartographie des épitopes des anticorps et pour tester des marqueurs de maladie en conditions cliniques.
Face à la nécessité d'analyser simultanément un plus grand nombre de protéines dans des échantillons limités, des recherches ont été entreprises pour améliorer la sensibilité et la rapidité des techniques de transfert sur membrane. Le double blot élimine les faux positifs dus à des interactions non spécifiques. Le far-western blot permet de détecter des interactions spécifiques entre les protéines. Le southwestern blot est utilisé pour identifier les protéines qui interagissent avec des séquences d'ADN spécifiques. Le transfert multibandelettes ("multistrip blotting") augmente le débit tout en minimisant la variabilité entre deux analyses. De nouvelles technologies sont en cours de développement pour réduire les quantités de protéines nécessaires pour produire un signal et améliorer les capacités quantitatives des analyses par western blot.
Notre Protein Blotting Handbook contient des trucs et astuces utiles pour vous aider à obtenir des résultats prêts à publier.
Articles techniques apparentés
- Technical Support in Antibody Basics includes basic structure, classes and normal immunoglobulin ranges.
- We offer a broad range of alkaline phosphatase enzymes and substrates that are optimized for conjugation to antibodies and other proteins for your specific application needs.
- Loading controls in western blotting application.
- Gelatin is a heterogeneous mixture of water-soluble proteins extracted by boiling skin, tendons, ligaments, bones, etc. in the water.
- The possible causes and potential remedies for poor or inconsistent transfer of proteins from a gel to the Western blot membrane. Optimal transfer conditions may vary depending on the molecular weight of the protein of interest.
- Afficher tout (32)
Protocoles apparentés
- Protocol for sample preparation for cell lysis and efficient protein extraction from cultured tissues and cells for subsequent Western blotting.
- Western blot protocol with workflow steps for different blot procedures, describing the electrophoretic transfer of proteins from SDS polyacrylamide gels to sheets of nitrocellulose. Also known as Immunoblotting protcol.
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)/nitro blue tetrazolium (NBT) is an ideal insoluble substrate for use with alkaline phosphatase. This system produces a blue-purple product. The intense color can be observed visually, is very stable, and will not fade upon exposure to light.
- This page describes chemiluminescence detection of GST-tagged proteins with Amersham ECL, Amersham ECL Prime, and Amersham ECL Select from GE Healthcare.
- The SNAP i.d. 2.0 Protein Detection System is the second generation of the SNAP i.d. method for detecting immunoreactive proteins on Western blots.
- Afficher tout (18)
Procédure
Électrophorèse sur gel
L'électrophorèse de protéines sur gel permet de séparer et de distinguer les protéines avant leur transfert. Le mélange de protéines préparé passe sur un gel de polyacrylamide qui trie les protéines en fonction de leur poids moléculaire et de leur charge.
Transfert sur membrane
Les protéines séparées par l'électrophorèse sur gel sont immobilisées par transfert sur une membrane en PVDF ou en nitrocellulose. Le transfert utilise un courant électrique pour faire passer les protéines du gel à la membrane (electroblotting).
Détection
La protéine cible est détectée soit à l'aide d'un anticorps primaire utilisé conjointement avec un anticorps secondaire conjugué à de la peroxydase de raifort ou de la phosphatase alcaline et avec un substrat chimioluminescent ou colorimétrique approprié, soit à l'aide d'un anticorps primaire ou secondaire marqué par fluorescence.
Pour continuer à lire, veuillez vous connecter à votre compte ou en créer un.
Vous n'avez pas de compte ?