Western Blotting
Western Blotting ist ein bewährtes Analyseverfahren für Nachweis, Analyse und Quantifizierung von Proteinen. Diese Methode wird häufig zum Nachweis spezifischer Proteinmoleküle in komplexen Proben wie Gewebehomogenaten und Zelllysaten verwendet. Beim Western Blotting werden die Proteine in der Regel durch Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf eine Polyvinylidendifluorid- (PVDF) oder Nitrozellulose-Membran übertragen. Nach dem Transfer der Proteine können diese zur Visualisierung angefärbt und durch Einsatz einer N-Terminus-Sequenz, Massenspektrometrie oder Immunnachweis direkt identifiziert werden.
Beim Western-Blotting-Immunnachweis werden Proteine durch ihre Bindung an spezifische Antikörper identifiziert. In der Regel wird ein primärer Antikörper in Kombination mit einem HRP- oder AP-konjugierten Sekundärantikörper für den chemilumineszenten oder kolorimetrischen Nachweis unter Einsatz eines geeigneten Substrats verwendet. Alternativ kann ein fluoreszenzmarkierter primärer oder sekundärer Antikörper zur direkten Visualisierung verwendet werden.
Western Blotting wird in der Biochemie häufig eingesetzt, um das Vorhandensein spezifischer Proteine nachzuweisen, das Ausmaß posttranslationaler Modifikationen zu bestimmen, die Proteinexpression bei Klonierungsanwendungen zu verifizieren und die Expressionsniveaus von Proteinen und Biomarkern zu analysieren. Darüber hinaus in der Antikörper-Epitopkartierung und in der Klinik für Tests auf Krankheitsmarker.
Die Notwendigkeit, mehr Proteine in begrenzten Proben gleichzeitig zu analysieren, hat die Forschung zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit von Blotting-Techniken vorangetrieben. Durch das Doppelblotting werden falsch-positive Ergebnisse aufgrund unspezifischer Wechselwirkungen vermieden. Far-Western-Blotting ermöglicht den Nachweis spezifischer Protein-Protein-Interaktionen. Das South-Western-Blotting dient der Identifizierung von Proteinen, die mit bestimmten DNA-Sequenzen interagieren. Durch Multistrip-Blotting wird der Durchsatz erhöht und gleichzeitig die Inter-Blot-Variabilität erhöht. Es werden neue Technologien entwickelt, um die zur Erzeugung eines Signals erforderlichen Proteinmengen zu verringern und die quantitativen Möglichkeiten des Western Blotting zu verbessern.
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Arbeitsablauf
Gelelektrophorese
Die Protein-Gelelektrophorese dient dazu, Proteine vor dem Blotting aufzutrennen. Das vorbereitete Proteingemisch durchläuft ein Polyacrylamidgel, um die Proteine nach Molekulargewicht und Ladung zu sortieren.
Übertragung auf eine Membran
Die auf dem Gel durch Elektrophorese aufgetrennten Proteine werden durch Übertragung auf eine PVDF- oder Nitrozellulose-Membran immobilisiert. Bei der Übertragung wird elektrischer Strom eingesetzt, um Proteine aus dem Gel auf die Membran zu ziehen (Elektroblotting).
Nachweis
Das Zielprotein wird mit einem primären Antikörper in Kombination mit einem HRP- oder AP-konjugierten sekundären Antikörper und einem geeigneten chemilumineszenten oder kolorimetrischen Substrat oder mit fluoreszenzmarkierten primären oder sekundären Antikörpern nachgewiesen.
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