Protein-Massenspektrometrie
Die Protein-Massenspektrometrie wird weitverbreitet zur Analyse biologischer Proben für die Entdeckung von Biomarkern, in der Proteomforschung und klinischen Anwendungen eingesetzt. Im Vergleich zu anderen Techniken, die für die Charakterisierung von Proteinen im großen Maßstab verwendet werden, ist die Massenspektrometrie aufgrund ihrer Eignung für komplexe Analysen zu einem primären Werkzeug in der Proteomik geworden.
Die Massenspektrometrie wird für den quantitativen Nachweis und die Charakterisierung von Proteinen auf der Grundlage ihrer Struktur, posttranslationaler Modifikationen und Interaktionen eingesetzt.
- Die Identifizierung von Proteinen umfasst typischerweise den chemischen oder enzymatischen Verdau von Proteinen zu Peptiden, die dann massenspektrometrisch analysiert und mit rechnergestützten Methoden oder durch Sequenzierung identifiziert werden.
- Posttranslationale Modifikationen können durch Veränderungen in der Masse der Aminosäurerückstände identifiziert werden. Modifikationsstellen können mit Hilfe von Sequenzierungs- oder Berechnungsverfahren abgebildet werden.
- Für die Glykananalyse und -profilierung werden enzymatische oder chemische Methoden zur Freisetzung von Glykananteilen aus Glykoproteinen verwendet, gefolgt von der Derivatisierung der freigesetzten Glykane für die Massenspektrenanalyse.
- Proteininteraktionen werden durch Affinitäts-Mitreinigung eines spezifischen Zielproteins mit allen interagierenden Proteinen bestimmt oder globaler durch Größenausschluss oder Ionenaustauschchromatographie vor der Analyse durch Massenspektrometrie untersucht.
Zugehörige technische Artikel
- Learn more about Mass Spectrometry or MS including what it is, what it is used for and how it works.
- Absolute Quantification (Protein-AQUA™™) is a targeted quantitative proteomics technique that exhibits robust efficacy and is being increasingly utilized for a wide variety of quantitative proteomics studies.
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- Standardize Your Research. We offer both the Universal Proteomics Standard and the Proteomics Dynamic range Standard as complex, well-defined, well characterized reference standards for mass spectrometry.
- In this study, we developed a rapid trypsin digest kit that, at elevated temperatures, yielded reliable, reproducible results in less than 2 hours on a wide variety of substrates for mass spectrometry.
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Zugehörige Protokolle
- Dr. Alan Robertson and Dr. Ben Davis at Vernalis, Ltd., UK, a provider of drug discovery and development services, have refined a novel protocol for the duallabelling of proteins using EnPresso® B Defined Nitrogen-free.
- SigmaMab Antibody Drug Conjugate Mimic, is a non-toxic drug mimic utilized as a standard for mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
- solution, 2 μg/mL in acetonitrile, analytical standard
- The development of modern mass spectrometry (MS) equipment with high resolution and mass accuracy has led to its use in analyzing glycans for both profiling and structural studies.
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Für die quantitative Proteomik können Proteine oder Peptide chemisch mit stabilen Isotopen mittels Tandem-Massenmarkierung (TMT) und iTRAQ oder metabolisch durch Einbau markierter Aminosäuren (SILAC) markiert werden. Der Vergleich der Einbindung schwerer und leichter Isotope ermöglicht eine relative Quantifizierung durch Korrelation von Massenspektren-Peak-Intensitäten mit Proteinhäufigkeiten. Für die absolute Quantifizierung können Proben mit isotopenmarkierten synthetischen Peptid- oder Proteinstandards für die Analyse der ausgewählten Reaktionsüberwachung (SRM) aufgestockt werden.
In der Protein-Massenspektrometrie werden die Massen verschiedener Proteine und Peptide durch Messung des m/z (Masse-zu-Ladung)-Verhältnisses ihrer Ionen in der Gasphase bestimmt. Massenspektrometer wandeln zunächst mit Hilfe einer Ionenquelle Proteinmoleküle in Gasphasen-Ionen um. Danach trennt ein Massenanalysator ionisierte Analyten auf der Grundlage des m/z-Verhältnisses. Ein Detektor zeichnet dann die Anzahl der Ionen bei jedem m/z-Wert auf. MALDI und Elektrospray-Ionisation (ESI) werden häufig zur Ionisierung von Peptiden oder Proteinen verwendet.
MALDI-TOF-Massenspektrometrie
MALDI ist eine Ionisierungsmethode, in der eine Laserenergie absorbierende Matrix verwendet wird, um Ionen mit minimaler Fragmentierung von Proteinmolekülen zu erzeugen. Die Probe wird zunächst mit einem geeigneten Matrixmaterial gemischt. Danach wird die Probe mit einem Impulslaser bestrahlt und damit Ablation und Desorption der Probe und des Matrixmaterials ausgelöst. Die Analytmoleküle werden dann vor der massenspektrometrischen Analyse durch Protonierung oder Deprotonierung in den ablatierten Gasen ionisiert.
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) werden Ionen mit Hilfe eines Elektrosprays erzeugt, bei dem eine Hochspannung an die flüssige Probe angelegt wird, um ein Aerosol zu erzeugen, wodurch Ionen mit minimaler Fragmentierung von Peptiden und Proteinen erzeugt werden. Die Elektrospray-Ionisation wird häufig bei der Kopplung der Massenspektrometrie mit der Flüssigkeitschromatographie (LC-MS) verwendet, da das Eluat der Flüssigkeitschromatographie direkt einem Elektrospray zur Tandemverarbeitung zugeführt werden kann.
Arbeitsablauf
Aufschluss und Markierung
Ortsspezifische Proteasen wie Trypsin werden zur Spaltung von Proteinen in kleine Fragmente verwendet, um eine Identifizierung zu ermöglichen, indem experimentelle Spektren mit theoretischen Spektren aus Proteindatenbanken abgeglichen oder mit Laufstandards verglichen werden. Für die relative Quantifizierung können Zellkulturen metabolisch mit stabilen Isotopen markiert werden, die durch Zufuhr von Aminosäuren aufgenommen wurden, oder es können Proben unter Einsatz chemischer Verfahren mit stabilen Isotopen markiert werden. Das Aufstocken von Proben mit isotopenmarkierten synthetischen Peptiden ermöglicht eine absolute Quantifizierung durch die Analyse der ausgewählten Reaktionsüberwachung (SRM).
Kalibrierung und Standardisierung in der Protein-Massenspektrometrie
Kalibrierstandards können als Kontrollen für die Probenanalyse dienen und zur Bestimmung der Proteinidentität, der experimentellen Empfindlichkeit, der Verdaueffizienz und als Hilfsmittel bei der chromatographischen Trennung und quantitativen Analyse verwendet werden.
Chromatographische Trennung
Die Chromatographie ermöglicht die Trennung von Proteinen und Peptiden in Proben, die in der Analyse leichter handzuhaben sind. Da mehrere unterschiedliche Peptide ähnliche Massen haben können, wird die HPLC häufig verwendet, um die gleichzeitige Zugabe von Peptiden mit sehr ähnlichen oder identischen Massen zum Massenspektrometer zu verhindern und so den Gesamtdynamikbereich von Messungen zu erhöhen.
Nachweis und Analyse
Proteine und Peptide werden vor Nachweis und Analyse mittels MALDI oder ESI ionisiert. In einem Massenanalysator werden die Ionen anhand ihrer m/z-Werte unterschieden. Daraus resultierende Fragmentierungsmuster können für die Identifizierung verwendet und Proben relativ durch Auswertung von Peak-Intensitätsverhältnissen von Proben, die durch Isotopenmarkierung differenziert wurden, oder absolut durch SRM-Analyse mit markierten internen Standards quantifiziert werden.
Highlights
Primer für die Markierung stabiler Isotope durch Aminosäuren in Zellkulturen (SILAC)
Massenspektrometrie-Workflow und Tools zur Überwachung von Proteinen durch Massenspektrometrie
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