HPLC großer Moleküle
Biomoleküle sind große, polymere chemische Verbindungen, die von lebenden Zellen produziert werden, als fundamentale Bausteine lebender Organismen dienen und viele lebenswichtige biologische Prozesse ausführen. Zu den wichtigsten Biomolekültypen gehören Proteine, Peptide, Polynukleotide, Kohlenhydrate, Lipide, Vitamine und Coenzyme. Die Art der Struktur großer Moleküle und Biomoleküle, ihre chemische Vielfalt, die Notwendigkeit, biologische Aktivität zu berücksichtigen, und komplexe Matrizes erfordern eine effiziente Charakterisierungstechnik. Obwohl es viele Trenn- und Analyseverfahren gibt, wird die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) am häufigsten eingesetzt. Aufgrund von vielen funktionellen Gruppen und Mehrfachkonformationen basiert die HPLC-Analyse von Biomolekülen auf verschiedenen Methoden wie Umkehrphasen-, Größenausschluss- oder Ionenaustausch-Chromatographie. Unabhängig von den angewandten Trenntechniken sind das effiziente Packen von Säulen und eine konsistente chemische Modifizierung der stationären Phase entscheidend für eine genaue und zuverlässige Trennung von Biomolekülen.
Zugehörige technische Artikel
- Identify and correct common HPLC problems to restore column performance. Get help with peak problems (peak splitting, peak tailing, peak fronting, etc.), retention time, purge noise, and loss of resolution with example chromatograms.
- Size-exclusion chromatography (SEC) columns and ready-to-use standards facilitate method development and increase robustness of protein SEC methods.
- Informative article on size exclusion chromatography columns for biomolecule separations. Using columns packed with sub-2 μm particles provides significant gains in efficiency over SEC columns packed with larger particles.
- Supelco’s product offering for biopolymer separations includes columns and media categorized by separation mode, as well as by column brand.
- BIOshell™ IgG 1000 Å C4 columns are highly suited for the reversed phase separation of high molecular weight compounds such as monoclonal antibodies with molecular weight of 150 kDa.
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Zugehörige Protokolle
- An optimized LC-MS/MS based workflow for low artifact tryptic digestion and peptide mapping of monoclonal antibody, adalimumab (Humira) using filter assisted sample preparation (FASP).
- A step-by-step protocol for released N-linked glycan analysis of the monoclonal antibody adalimumab, based on UHPLC-FLR-MS and procainamide labeling.
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- HPLC Analysis of Glycans
- Larger porous shell particles with narrow particle size distribution, used in Supelco's BIOshell™ columns for the reversed-phase U/HPLC analysis of peptides and proteins, provide increased efficiency per unit pressure drop.
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Umkehrphasen-HPLC von Biomolekülen
Die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) ist eine empfindliche und vielseitige Technik, die zur Trennung und Analyse von Proteinen, Proteinfragmenten und Peptiden verwendet wird. In der RP-HPLC wird eine unpolare stationäre Phase und eine polare mobile Phase verwendet. Die Retention von Proteinen und Peptiden auf der stationären Phase folgt Adsorptions- und Verteilungsmechanismen. Hydrophobe Proteinregionen lagern sich reversibel an der stationären Phase an. Proteine werden eluiert, indem der Polaritätsgradient der mobilen Phase in den unpolaren Bereich verändert wird. Die Auflösung kann durch Poren- und Partikelgröße, Säulenlänge und die Art der an die stationäre Phase gebundenen Kohlenwasserstoffkette beeinflusst werden.
Größenausschlusschromatographie (SEC)
Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist ein nicht-denaturierender Chromatographie-Modus, in dem Moleküle aufgrund ihrer Größe (d.h. hydrodynamischer Radius) getrennt werden. Dieser Modus beruht nicht auf der Interaktion des Analyten mit der stationären Phase, sondern vielmehr auf einem zufälligen Fluss des Analyten durch die Partikelporen der stationären Phase. Analyten mit hohem Molekulargewicht eluieren früher, da sie ganz oder teilweise aus den Partikelporen der stationären Phase ausgeschlossen sind, während Analyten mit niedrigerem Molekulargewicht später eluieren, da sie mehr Zeit benötigen, um durch die Partikelporen zu navigieren. SEC wird zur Charakterisierung von Aggregaten und Fragmenten monoklonaler Antikörper (mAbs), zur Abschätzung unbekannter Proteinmolekulargewichte und zur Bestimmung der Stabilität von Proteinformulierungen verwendet.
Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
Die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist ein Chromatographie-Modus, in dem Analyten auf Grundlage des Interaktionsgrades zwischen hydrophoben Analytteilen und hydrophoben Liganden der stationären Phase getrennt werden. Aufgrund ihres geringeren Molekulargewichts und der geringeren Neigung zur Faltung wird die HIC in der Regel nicht zur Peptidtrennung eingesetzt. In hohen Salzkonzentrationen können die Proteinhydratationsschichten so gestört sein, dass hydrophobe Oberflächenbereiche an die unpolare stationäre Phase binden. Die Auswahl der Salze wird von der Hofmeister-Reihe vorgegeben, in der Kationen und Anionen nach ihrer Fähigkeit klassifiziert werden, Proteinhydratationsschichten zu stören (chaotrop) oder die Bildung von Proteinhydratationsschichten zu fördern (kosmotrop). Zu den typischen Salzen gehören Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat und Natriumsulfat. Die hydrophobe Interaktionschromatographie wird gegenwärtig zur Bestimmung des Drug-to-Antibody-Ratio-Profils (DAR) von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (AWK) eingesetzt.
Ionenaustauschchromatographie (IEX)
Die Ionenaustauschchromatographie (IEX) ist ein Chromatographieverfahren, in dem Analyten nach Ladung getrennt werden. Proteine und Peptide sind amphoter, d.h. sie weisen sowohl saure als auch basische Funktionalitäten auf. Zu den sauren Proteinfunktionalitäten gehören Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystein, Tyrosin und das C-Terminus α-Carboxylat. Zu den basischen Proteinfunktionalitäten gehören Arginin, Histidin, Lysin und das N-Terminus α-Amin. Biotherapeutische Ladungsvarianten können durch IEX erkannt und behoben werden. Ladungsvarianten können aus einer Fehltranslation des Transkripts der Messenger-RNA (mRNA) und/oder posttranslationalen Modifikationen wie Desamidierung, Oxidation oder Glykosylierung entstehen.
Eine IEX-Säule muss auf Grundlage des isoelektrischen Punkts (pI) des Analyten ausgewählt werden. Wenn der pH der mobilen Phase niedriger als der pI ist, wird der Analyt positiv geladen und bindet an eine Kationenaustauschersäule. Wenn der pH-Wert der mobilen Phase über dem pI liegt, wird der Analyt negativ geladen und bindet an eine Anionenaustauschersäule.
Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie beruht auf einer spezifischen Interaktion zwischen einem Analyten und einem Liganden der stationären Phase. Im Idealfall bindet sich nur der Zielanalyt an die stationäre Phase, während alle anderen Probenkomponenten die Säule passieren. Es wird dann eine zweite mobile Phase durch die Säule geleitet, um den Analyten zu eluieren.
Die Protein-A-Chromatographie ist die in der biopharmazeutischen Industrie am häufigsten eingesetzte Form der Affinitätschromatographie. Protein A ist ein 42 kDa Oberflächenprotein, das in der Zellwand von S. aureus vorkommt. Dieses Protein bindet spezifisch an die schwere Kette in der Fc-Region von IgG, was dies zum idealen Mechanismus zur Trennung der IgG von den restlichen Probenbestandteilen macht. Die meisten Protein A-Säulen werden durch Immobilisierung des Proteins auf einem porösen, organischen Partikel hergestellt. Es wurde jedoch ein monolithisches Material für die Protein-A-Chromatographie hergestellt, das einen hohen Probendurchsatz bei verschiedenen Fließraten ermöglicht, ohne dass die Effizienz darunter leidet.
Highlights
Berechnen Sie die Einsparungen in Bezug auf Laufzeit und Lösungsmittelverbrauch, wenn Sie eine Methode von HPLC-Bedingungen auf UHPLC-Bedingungen umstellen. Sie erhalten eine Anleitung zur Änderung des Gegendrucks sowie zur Anpassung des Injektionsvolumens und der Gradientenbedingungen.
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