Protein- & Nukleinsäure-Wechselwirkungen
Proteine sind das Arbeitspferd unter den Molekülen im Zellinnern und für die unzähligen biologischen Aktivitäten verantwortlich, die in Zellen vor sich gehen, damit diese funktionieren und überleben. Interessanterweise interagieren auch verschiedene Proteinsätze mit der DNA. Die DNA innerhalb unserer Chromosomen ist oft eng um Proteine herum gebündelt, die innerhalb des Chromosoms als Chromatid bezeichnet werden. Diese Protein-DNA-Bündel helfen dabei, die DNA innerhalb des Zellkerns in eine kompakte Form zu bringen. Es wurden leistungsfähige molekulare Werkzeuge und Techniken von Wissenschaftlern entwickelt, um diese Protein-DNA-Bündel und andere DNA-bindende Proteinkomplexe für Downstream-Anwendungen zu isolieren.
Immunpräzipitation
Bei der Immunpräzipitation mit Verwendung hochspezifischer Antikörper gegen RNA- und DNA-bindende Proteine (z.B. Transkriptionsfaktoren) können Wissenschaftler die Regulierung molekularer Pfade bewerten und die Genfunktion sowohl in gesunden als auch in kranken Geweben besser verstehen.
Zur Untersuchung von Protein-RNA- und Protein-DNA-Interaktionen stehen derzeit zahlreiche Technologien und Methoden zur Verfügung, die sich auch für weitere Downstream-Analysen eignen. Beispielsweise werden Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP) häufig zur Untersuchung von Transkriptionsfaktor-DNA-Interaktionen für Genexpressions- und epigenetische Modifikationsstudien verwendet. Dagegen werden RNA-Präzipitations-Assays (RIP) häufig zur Untersuchung von Proteinen verwendet, die an mRNA, nicht-kodierende RNA, miRNA und virale RNA binden. Eine häufige Herausforderung bei Immunpräzipitationsstudien ist die Spezifität und/oder der Zugang des Antikörpers zum Zielprotein. Um einige dieser Probleme zu umgehen, setzen Wissenschaftler die Technologie rekombinanter Proteine ein, um modifizierte Proteine mit eindeutigen Tags, wie dem Hämagglutinin (HA)-Tag, zu exprimieren, die vom entsprechenden Antikörper mit hoher Spezifität erkannt werden.
Proximity Ligation Assay-Technologie
Interessanterweise haben Wissenschaftler, die sich Protein-DNA-Technologien zunutze machen, neue Werkzeuge und Methoden zur Bewertung von Protein-Protein-Interaktionen entwickelt. Mit hoher Spezifität und Sensitivität erleichtert die Proximity Ligation Assay-Technologie (PLA) den in situ-Nachweis von körpereigenen Proteinen, Proteinmodifikationen und Proteininteraktionen. Ähnlich wie bei Immunpräzipitationstechniken werden im PLA-Assay hochspezifische Primärantikörper zur Erkennung der beiden Zielproteine verwendet. Zur Bindung an die Primärantikörper werden jedoch modifizierte oligonukleotidmarkierte Sekundärantikörper verwendet, die als PLA-Sonde fungieren. Nur wenn beide Proteine vorhanden sind und sich in der Nähe befinden, verbinden sich die hybridisierenden Adapter-Oligos mit den PLA-Sonden. Durch die Zugabe von Ligase wird ein geschlossenes, zirkuläres DNA-Template gebildet. Mit dem neu gebildeten zirkulären DNA-Template ist nun eine Rolling-Circle-Amplifikation mit der zusätzlichen DNA-Polymerase möglich und es wird letztendlich ein immens verstärktes Signal erzeugt, das an die PLA-Sonde gebunden ist. Die Auswahl der geeigneten Protein- und Nukleinsäure-Interaktionstechnologie wird weitgehend von den Downstream-Anforderungen des Wissenschaftlers bestimmt.
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