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MilliporeSigma

Assessing the Efficacy of Mdm2/Mdm4-Inhibiting Stapled Peptides Using Cellular Thermal Shift Assays.

Scientific reports (2015-07-15)
Ban Xiong Tan, Christopher J Brown, Fernando J Ferrer, Tsz Ying Yuen, Soo Tng Quah, Boon Hong Chan, Anna E Jansson, Hsiang Ling Teo, Pär Nordlund, David P Lane
RESUMEN

Previous publications on stapled peptide inhibitors against Mdm2/Mdm4-p53 interactions have established that this new class of drugs have the potential to be easily optimised to attain high binding affinity and specificity, but the mechanisms controlling their cellular uptake and target engagement remain elusive and controversial. To aid in understanding the rules of peptide and staple design, and to enable rapid optimisation, we employed the newly-developed cellular thermal shift assay (CETSA). CETSA was able to validate stapled peptide binding to Mdm2 and Mdm4, and the method was also used to determine the extent of cellular uptake, cellular availability, and intracellular binding of the endogenous target proteins in its native environment. Our data suggest that while the stapled peptides engage their targets intracellularly, more work is needed to improve their cellular entry and target engagement efficiency in vivo. CETSA now provides a valuable tool to optimize such in vivo properties of stapled peptides.

MATERIALES
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, for molecular biology, 1.00 M±0.01 M
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, anhydrous, ≥98%
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Sigma-Aldrich
DL-Ditiotreitol solution, BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
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Supelco
DL-Ditiotreitol solution, 1 M in H2O
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, powder, <200 μm
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, BioUltra, for molecular biology, 2 M in H2O
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, BioReagent, suitable for insect cell culture, ≥97.0%
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Sigma-Aldrich
Z-Leu-Leu-Leu-al, ≥90% (HPLC)
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, PCR Reagent, 25 mM MgCI2 solution for PCR
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, AnhydroBeads, −10 mesh, 99.9% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
5-Carboxyfluorescein, BioReagent, suitable for fluorescence, ≥95% (HPLC)
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, AnhydroBeads, −10 mesh, 99.99% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, 0.1 M
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Sigma-Aldrich
Fmoc-(R)-2-(7-octenyl)Ala-OH
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, BioUltra, for molecular biology, ~0.025 M in H2O
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