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PTP1B检测试剂盒，比色法

• 分類程式碼代碼: 41116133

屬性

• 用途: sufficient for 96 tests
• 品質等級: 100
• 包裝: pkg of 1 96-well plate(s)
• 製造商／商標名: Calbiochem^®
• 儲存條件: OK to freeze; avoid repeated freeze/thaw cycles
• 輸入: sample type purified enzyme(s)
• 檢測方法: colorimetric
• 運輸包裝: wet ice
• 儲存溫度: −70°C

描述

一般說明

用于测量PTP1B活性的比色分析试剂盒。这种方便的96孔分析可用于筛选PTP1B活性的抑制剂和调节剂。

成分

人重组PTP1B（目录号539735）、PTP1B底物（目录号539737）、检测缓冲液、磷酸盐检测剂、磷酸盐标准品、RK-682抑制剂（目录号557322）½容量板和用户协议。

警告

毒性：多个毒性值，请参阅MSDS（O）

規格

试验时间：2 h

原則

在进行分析之前，请阅读整个方案。仔细记录每个试剂盒组分的处理和储存条件。如有必要，请联系CALBIOCHEM^®技术服务部寻求帮助。



注：以下规程仅供参考。最佳实验条件将因所研究的参数而异，必须由个人用户确定。



Calbiochem PTP1B分析试剂盒，比色法是一种非放射性分析方法，用于测量纯化制剂中的PTP1B活性，并用于抑制剂或激活剂筛选。

準備報告

1.解冻所有试剂盒组分，并将PTP1B酶、PTP1B底物（IR5）和分析缓冲液置于冰浴上；在室温（RT）下储存红色试剂。通过将88 µl 2X测定缓冲液和88 µl dH₂O添加到500 µg纯肽中复溶PTP1B底物至1.5 mM。涡旋。复溶后，分装并冷冻保存（-70°C）。3.制备磷酸盐标准曲线：a.通过用600 µl dH₂O稀释600 µl 2X测定缓冲液来制备1.2 ml 1X测定缓冲液。b.将移液管分为两组，每组六个孔：100、97.5、95、90、80和70 µl 1X测定缓冲液。c.用移液管将100 µM磷酸盐标准溶液的0、2.5、5、10、20和30 µl按相同顺序移入相同的孔中。d.这些孔将分别含有0、0.25、0.5、1.0、2.0和3.0 nmol无机磷酸盐。注：重复执行标准曲线。

儲存和穩定性

自收到之日起，将1/2体积板在室温下储存，其余成分在-70°C下储存，以保持最高稳定性。为了保持最大的酶活性，必须非常小心地处理PTP1B。在RT水浴中快速解冻，或用手指摩擦解冻，然后立即存放在冰浴中。其余未使用酶应立即置于-70°C下冷冻。为了尽量减少冻融循环次数，将PTP1B等分放入单独的管中，并在-70°C下储存。

分析報告

用标准曲线将A₆₂₀转化为纳摩尔磷酸盐。1.将标准曲线数据绘制为A₆₂₀nm与nmol PO₄^2-。2.使用适当的例程获得数据的一条或多条直线拟合。请注意，在磷酸盐浓度从0到3 nmol的整个范围内，曲线图可能不是线性的。如下图所示，两个线性拟合，一个用于0至1 nmol磷酸盐，另一个用于1至3 nmol磷酸盐，可以产生A₆₂₀与磷酸盐量的更精确相关性。3.使用适当绘图的斜率和Y截距计算特定数据点的磷酸盐释放量。4.示例（使用下图中的标准曲线进行样品计算）：a）测量的_A620=0.180。由于该A低于图中1 nmol点的值，因此选择0到1 nmol拟合，即y = 6.58x - 0.386。b）用A₆₂₀代替x，并用nmol PO₄^2-代替y，得到：nmol PO₄^2- = 6.58(A₆₂₀) - 0.386nmol PO₄^2- = 6.58(0.180) - 0.386nmol PO₄^2- = 0.798注：为了获得最高的准确度，应为每一组新的分析数据绘制一条标准曲线。这将标准化样品中游离磷酸盐的变化、与绿色试剂孵育的时间以及其他实验因素。时间进程和费率计算1.如上所述，使用标准曲线，将一系列时间点的A₆₂₀测量值转换为nmol磷酸盐。2.绘制磷酸盐的nmol与时间的关系图，并获得以nmol/min为单位的斜率。如果斜率在以后逐渐减小，则将斜率确定中使用的时间点限制在绘图的最早线性部分。3.计算所选底物浓度下每孔所含磷酸肽的总量可能有用。例如，在100 l反应中75 M IR5肽处为：75 x 10^-6 mol/L x 100 x 10^-6 L = 7500 x 10^-12 mol = 7.5 nmol4.尽管在可能的情况下，最好从转化为产物的最初几%的基质中获得初始速率数据，但这可能不会产生足够的信号来进行准确的速率估计。在实践中，PTP1B在75 M IR5底物下，至少前15%的水解底物（~1 nmol磷酸盐）的时间历程图保持线性。测试样品/抑制剂数据1.重要的是获得“时间零点”测量值，并从对照和测试样品/抑制剂值中减去该值（以nmol磷酸盐表示）。同样，获得准确t=0测量值的简便方法是将25 l红色试剂添加并混合到50 l 2X酶中，然后混合到50 l 2X底物中（参见时间过程说明）。2.将活性计算为控制百分比
3.必要时，添加其他对照。例如，虽然极低的读数通常表明试样是一种有效的抑制剂，但该化合物有可能干扰显色。在这种情况下，适当的控制方法是比较从1 nmol磷酸盐（10 l 100 M磷酸盐标准溶液）中获得的显色反应，添加和不添加试验化合物[仅缓冲液，不含酶或PTP1B底物（IR5）]；参见磷酸盐标准曲线说明）。

阳性对照
重组PTP1B

其他說明

Elchebly, M., et al. 1999.Science 283, 1544.
Puius, Y.A., et al. 1997.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94, 13420.
Liu, F., et al. 1996.J. Biol. Chem. 271, 31290.
Fujii, S., et al. 1995.Neurosci. Lett.187, 133.
Harder, K.W., et al. 1994.Biochem.J. 298, 395.
Zhang, Z. Y., et al. 1993.Proc.Natl.Acad.Sci. USA90, 4446.
Martin, B., et al. 1985.J. Biol. Chem. 260, 14932.

法律資訊

CALBIOCHEM is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

安全資訊

• 象形圖: GHS05,GHS07
• 訊號詞: Warning
• 危險聲明: H290 - H315 - H319 - H335
• 防範說明: P234 - P261 - P264 - P271 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338
• 危險分類: Eye Irrit. 2 - Met. Corr. 1 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
• 標靶器官: Respiratory system
• 儲存類別代碼: 8A - Combustible, corrosive hazardous materials
• 水污染物質分類（WGK）: WGK 3