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  • R-Smad signaling-mediated VEGF expression coordinately regulates endothelial cell differentiation of rat mesenchymal stem cells.

R-Smad signaling-mediated VEGF expression coordinately regulates endothelial cell differentiation of rat mesenchymal stem cells.

Stem cells and development (2015-01-21)
Wen-Jia Ai, Jie Li, Shao-Mang Lin, Wen Li, Chi-Zhuai Liu, Wei-Ming Lv
RESUMEN

A low-efficiency yield hinders the use of stem cells as a source of endothelial cells (ECs) for therapeutic vascularization, and the diversity of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily has undermined understanding the effects of its potent vascularization-inducing. Herein, we studied the role of the TGF-β superfamily in EC differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) induced by Smad2/3 and Smad1/5/8 signaling. MSCs that had been sorted by flow cytometry as CD31-negative were cultured for 14 days in medium supplemented with vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) as the control. The Smad2/3 pathway was activated by TGF-β1 and Smad1/5/8 by bone morphogenetic proteins (BMPs). In the early phase in the Smad2/3-activated group, there were 10% CD31-positive cells, which was significantly higher than in the control group. A low Smad1/5/8 phosphorylation level after BMP4 activation doubled the number of CD31-positive cells, while a higher phosphorylation level after BMP9 activation showed no effect. A Smad2/3 inhibitor initially blocked differentiation but later promoted it, while a Smad1/5/8 inhibitor reversed the induction observed with BMPs. Moreover, the positive effects of R-Smad on differentiation were weakened by the VEGF neutralizing antibody, and a Smad3 inhibitor decreased VEGF expression and blocked differentiation in both the early and late phases. In conclusion, differentiation of ECs from MSCs via Smad2/3 signaling is stage dependent. Activation, particularly by Smad3, significantly promotes differentiation at an early phase but later is suppressive. A low Smad1/5/8 phosphorylation level has a positive effect, and R-Smad effects are partly mediated by VEGF.

MATERIALES
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Sigma-Aldrich
DAPI, for nucleic acid staining
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, powder, suitable for cell culture, γ-irradiated
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, BioXtra, ≥99.0%, crystalline
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Hydrocortisone, BioReagent, suitable for cell culture
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Ácido L-ascórbico, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥98%
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Sigma-Aldrich
Hydrocortisone, γ-irradiated, powder, BioXtra, suitable for cell culture
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Sigma-Aldrich
Hydrocortisone, ≥98% (HPLC)
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Ethylenediaminetetraacetic acid solution, 0.02% in DPBS (0.5 mM), sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, reagent grade, crystalline
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Sigma-Aldrich
Ethylenediaminetetraacetic acid, anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
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Ethylenediaminetetraacetic acid, 99.995% trace metals basis
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Ácido L-ascórbico, reagent grade
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Ácido L-ascórbico, meets USP testing specifications
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Vascular Endothelial Growth Factor human, VEGF, recombinant, expressed in E. coli, powder, suitable for cell culture
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Ethylenediaminetetraacetic acid, ACS reagent, 99.4-100.6%, powder
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Ácido L-ascórbico, FCC, FG
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, 99%
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, BioUltra, ≥99.5% (RT)
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Ethylenediaminetetraacetic acid, BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
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VEGF human, Animal-component free, recombinant, expressed in E. coli, ≥98% (SDS-PAGE), ≥98% (HPLC), suitable for cell culture
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Ácido L-ascórbico, ACS reagent, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Vascular Endothelial Growth Factor from mouse, VEGF, recombinant, expressed in E. coli, powder, suitable for cell culture
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Hydrocortisone, meets USP testing specifications
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Sigma-Aldrich
Ethylenediaminetetraacetic acid, purified grade, ≥98.5%, powder
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, Ph. Eur., 99.7-100.5% (oxidimetric)
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Sigma-Aldrich
SIS3, ≥98% (HPLC), powder
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Sigma-Aldrich
GDF-2 human, recombinant, expressed in CHO cells, ≥95% (SDS-PAGE), ≥95% (HPLC), suitable for cell culture
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Sigma-Aldrich
Ácido L-ascórbico, puriss. p.a., ≥99.0% (RT)
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