조직 해리(Dissociation) 가이드: 콜라겐 분해효소(Collagenase), Dispase 및 Liberase 효소 유형

조직 해리 효소에 대한 일반 정보

• 콜라겐 분해효소에 대한 설명
• 콜라겐 분해효소 제품
• Roche의 콜라겐 분해효소 및 Liberase^® 효소
• 콜라겐 분해효소 분석법
• 콜라겐 분해효소 조직 소화/해리 문제 해결 및 참조
• 참고문헌

콜라겐 분해효소는 동물의 조직을 하나로 결합하는 고유의 콜라겐을 분해하는 효소이며, 다양한 미생물과 여러 다른 동물 세포에 의해 만들어집니다¹. 가장 강력한 콜라겐 분해효소는 혐기성 박테리아인 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)에서 분비된 “미가공(crude)” 콜라겐 분해효소입니다. 당사는 원래 MacLennan, Mandl 및 Howes²에 기술된 1953년 발효 및 정제 공정을 채택했지만, 최종적으로 더 높은 수준의 활성 제품으로 개선했습니다. "미가공" 콜라겐 분해효소는 물질이 조직을 분해하기 위해 함께 작용하는 콜라겐 분해효소 외에도 여러 다른 효소의 혼합물이라는 사실을 알려드립니다. 현재 콜라겐 분해효소는 두 가지 형태로 존재하는 것으로 알려져 있습니다^3,4. 몇 가지 예외를 제외하고 다른 상용 콜라겐 분해효소는 모두 C. 히스톨리티쿰에서 만들어지거나, 대장균(Escherichia coli)이 C. 히스토리티쿰에서 복제된 유전자를 발현하는 재조합형 버전으로 만들어집니다.

콜라겐 분해효소에 대한 설명

아래 표에 표시된 다양한 콜라겐 분해효소 제품은 각각 다른 제품보다 일부 조직(근육, 췌장, 심장, 지방) 유형을 더 잘 소화시킨다는 점에 의해 개발되었습니다. 효소 활성 사양을 충족하는 것 외에도, 당사의 모든 콜라겐 분해효소 제품은 쥐에서 얻은 다양한 조직으로 소화 테스트를 통과해야 합니다. "세포 배양 테스트"라고도 부르는 제품은 세포 독성이 없음을 확인하기 위해 포유류의 세포주로 추가 테스트를 거쳤습니다.

더 많이 사용되는 콜라겐 분해효소 제품 중 일부를 이용해 제조된 멸균 필터(0.2 mm) 버전도 아래에 나열되어 있습니다.

당사의 정제 콜라겐 분해효소 제품에는 미량의 카제이나제(단백질 분해) 또는 클로스트리페인 활성만 있습니다. 정제 VII형(Type VII) 콜라겐 분해효소는 세포 배양 검사 및 멸균 여과 버전으로도 제공됩니다.

콜라겐 분해효소 제품 – 미가공 콜라겐 분해효소, 크로마토그래피 정제, 단백질 분해 활성 억제제가 있는 콜라겐 분해효소 및 혼합물

범용 미가공 콜라겐 분해효소

a, b FALGPA 및 콜라겐 분해효소 소화기(CDU)는 모두 mg/고체당 단위로 제공됩니다.

제품	주석	FALGPAa	CDUsb
C0130	범용	0.25~1.0	> 125
C1639, Type I-S	C0130의 멸균 필터 버전	0.25~1.0	> 125
C9891, Type IA	범용 Type I의 두 번째 버전	0.5~2.0	> 125
C2674, Type IA	C9891의 세포 배양 테스트 버전	0.5~2.0	> 125
C5894, Type IA-S	C9891의 멸균 필터 버전	0.5~2.0	> 125
C9722, Type IA-S	C9891의 세포 배양 테스트 및 멸균 필터 버전	0.5~2.0	> 125

미가공 콜라겐 분해효소, 사용 테스트

a, b FALGPA 및 콜라겐 분해효소 소화기(CDU)는 모두 mg/고체당 단위로 제공됩니다.

제품	주석	FALGPA a	CDUs b
C6885, Type II	인슐린에 대한 세포 표면 수용체가 손상되지 않은 지방(지방질) 세포의 소화 및 배출에 적합한 것으로 테스트되었습니다5,6.	0.5~2.0	> 125
C1764, Type II-S	C6885의 멸균 필터 버전	0.5~2.0	> 125
C5138, Type IV	생균 쥐의 간 세포(hepatocytes)의 소화 및 배출에 적합한 것으로 테스트되었습니다7.	0.5~2.0	> 125
C1889, Type IV-S	C5138의 멸균 필터 버전	0.5~2.0	> 125
C2139, Type VIII	지방 조직 테스트(C6885 참조)5,6와 간 조직 테스트(C5138 참조)7를 모두 통과했습니다.	0.5~2.0	> 125
C9263, Type V	쥐 췌장에서 얻은 랑게르한스섬(인슐린 생성 세포)의 소화 및 배출에 적합한 것으로 테스트되었습니다8,9.	1.0~3.0	> 125
C2014, Type V-S	C9263의 멸균 필터 버전	1.0~3.0	> 125
C7657, Type XI	콜라겐 분해효소 활성이 가장 높음 - 쥐 췌장에서 랑게르한스섬(인슐린 생성 세포)의 소화 및 배출에 적합한 것으로 테스트되었습니다8,9.	2.0~5.0	> 1,200
C9407, Type XI	C7657의 세포 배양 테스트 버전	2.0~5.0	> 1,200
C4785, Type XI-S	C7657의 멸균 필터 버전	2.0~5.0	> 1,200
C9697, Type XI-S	C7657의 세포 배양 테스트 및 멸균 필터 버전	2.0~5.0	> 1,200

크로마토그래피 정제 콜라겐 분해효소

a, b FALGPA 및 콜라겐 분해효소 소화기(CDU)는 모두 mg/고체당 단위로 제공됩니다.

제품	주석	FALGPAa	CDUsb
C0255, Type III	단백질 분해효소 활성이 미량 포함된 정제 콜라겐 분해효소	4~12	≥ 250
C0773, Type VII	정제 콜라겐 분해효소에는 대체로 단백질 분해효소와 클로스트리파인(Clostripain)이 없습니다.	4~12	1,000 ~ 3,000
C2799, Type VII	C0773의 세포 배양 테스트 버전	4~12	1,000 ~ 3,000
C2399, Type VII-S	C0773의 멸균 필터 버전	4~12	1,000 ~ 3,000
C9572, Type VII-S	C0773의 세포 배양 테스트 및 멸균 필터 버전	4~12	1,000 ~ 3,000

단백질 분해 활성을 가진 미가공 콜라겐 분해효소

a, b FALGPA 및 콜라겐 분해효소 소화기(CDU)는 모두 mg/고체당 단위로 제공됩니다.

제품	주석	FALGPA a	CDUs b
C6079, Type S	Type XI 콜라겐 분해효소와 트립신 단백질 분해효소 억제제의 혼합물입니다. 쥐 췌장에서 얻은 랑게르한스섬(인슐린 생성 세포)의 소화 및 배출에 적합한 것으로 테스트되었습니다8,9.	2~5	최소 1,000

Collagenase Blends™

이 제품들은 콜라겐 분해효소 소화에서 로트 간 재현성을 높이기 위한 목적으로 개발되었습니다. 정제 클로스트륨 중성 단백질 분해효소에 대한 정제 콜라겐 분해효소(Blend F)의 비율에 따라 연구자들에게 다양한 소화 옵션을 제공하기 위해 블렌드 H와 L까지 다양합니다.

a, c FALGPA 및 콜라게나아제 소화기(CDU)는 모두 mg/고체당 단위로 제공됩니다.

제품	주석	FALGPAa	Proteasec
C7926, Blend F	지배적인 순수 콜라겐 분해효소입니다. CDU에 비해 FALGPA 활성이 높기 때문에 Type II 형태의 콜라겐 분해효소가 대부분 존재하는 것으로 추정됩니다.	최소 2.0	< 10
C8051, Blend H	콜라겐 분해효소 활성과 함께 일부 중성 단백질 분해효소 활성이 포함됩니다.	최소 1.0	최소 10
C8176, Blend L	순수 콜라겐 분해효소에 중성 단백질분해효소 활성이 더 많이 포함됩니다.	< 1.0	최소 40

Roche의 콜라겐 분해효소 및 Liberase^® 효소

Roche의 콜라겐 분해효소는 직관적인 설계와 신뢰성을 바탕으로 일상적이면서 중요한 애플리케이션에 일관된 성능과 재현성 있는 결과를 제공합니다. 콜라겐 분해효소는 간세포, 지방 세포, 췌장도, 상피 세포, 근육 세포 및 내피 세포와 같은 많은 유형의 조직으로부터 세포를 제조하는 데 적합합니다. 그러나 조직의 파괴와 관련되어 각 로트의 효소 적합성은 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한 Liberase^® 효소 기술은 고도로 정제된 콜라겐 분해효소 I 및 II 효소를 Dispase^® 또는 서몰리신(Thermolysin)과 결합하여 광범위한 조직 유형의 해리를 촉진합니다.

Liberase 연구 등급 적용 가이드

*간행물 기반 데이터

조직 유형	TL	TM	TH	DL	DH
간		+			+
신장		+		++
피부				+	++
심장		+	+		+
췌장(도)	++			+
림프절*	++	+
비장*	++
폐*	++	++
난소 조직*		++
지방 조직*		++
각막*		++

Dispase 효소

Roche에서 제공하는 효소와 함께, 당사는 고도로 정제된 고객의 특정한 애플리케이션 요구에 맞춘 신뢰할 수 있는 조직 해리 시약을 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 세포막을 손상시키지 않는 부드러운 효소인 dispase는 체외에서 성장하는 다양한 조직과 세포의 분리와 현탁 배양을 위한 세포 뭉침 현상을 방지하는 데 적합합니다.

콜라겐 분해효소 분석법

정제 콜라겐 분해효소의 Type I 및 Type II 형태는 고유 콜라겐 및 합성 기질에 대해 특이성 및 상대 활성량이 다릅니다. 이 두 가지 콜라겐 분해효소는 대부분 분석에 사용되는 두 가지 다른 기질 중 하나에 대한 선호 결과로 구별할 수 있습니다. 콜라겐 분해효소 소화기(CDU) 분석법^10,11은 주로 콜라겐 분해효소 I의 활성을 측정하며, 여기에서 긴 비변성 콜라겐 단백질의 세 개 나선형 사슬 중 두 개를 절단합니다. 콜라겐 분해효소 II 활성은 두 번째 콜라겐 분해효소 소화 검사에서 N-[3-(2-Furyl)acryloyl)]-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA, 제품 번호 F5135 참조)라는 짧은 합성 펩타이드를 절단하는 이 효소의 능력에 의해 측정됩니다^12,13. 콜라겐 분해효소 I 또는 II의 정제 준비는 이 효소의 두 가지 형태의 혼합물과 비교할 때 다양한 유형의 콜라겐 또는 포유류 조직을 소화하는 데 덜 효과적인 것으로 나타났습니다. 이 효소의 콜라겐 분해효소 I 및 II 형태만 포함하는 정제 콜라겐 분해효소는 전체 미가공 콜라겐 분해효소 또는 정제 콜라겐 분해효소와 다양한 단백질 가수분해효소의 조합보다 조직을 소화하는 데 덜 효과적입니다. 순수 콜라겐 분해효소와 자연적으로 진화한 다른 고유 단백질 분해효소인 클로스트리파인(Clostripain)과 아미노펩티다아제(aminopeptidase)들의 조합은 서로 다른 동물 조직의 콜라겐을 소화하는 데 도움을 주는 것이 분명합니다. 조직 소화에 있어서는 미가공 콜라겐 분해효소 제품이 항상 가장 효과적이었습니다. 일부 연구자들은 조직을 소화하기 위해 트립신 또는 서브틸리신과 같은 단백질 가수분해효소와 크로마토그래피로 정제된 콜라겐 분해효소의 혼합을 시도했습니다.

콜라겐 분해효소 활성에 대한 CDU 및 FALGPA 분석 외에도, 당사는 콜라겐 분해효소 제품의 단백질 분해효소 활성을 살펴보기 위해 카제이나제(Caseinase)^14,15, 클로스트리파인 및 트립신 활성에 대한 각 제품 로트를 테스트했습니다. 카제이나제 분석은 동물 조직의 소화를 돕는 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 세 가지 분석 중 가장 중요합니다. 활성화되기 위해서는 미가공 콜라겐 분해효소에 존재하는 클로스트리파인이 감소되어야 하기 때문에(예: 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 처리) 이 효소는 실험실에서 조직 해리 과정에 거의 영향을 미치지 않을 것입니다. 일부 연구원들은 클로스트리파인이 인체에 해롭거나 독성이 있을 수 있다고 보고했기 때문에 모니터링되어야 합니다.

효소 사양을 충족하는 많은 콜라겐 분해효소제품도 쥐에서 얻은 다양한 조직으로 사용 테스트를 거쳤습니다. Type II(C6885, C1764) 및 Type VIII(C2139) 콜라겐 분해효소 로트는 쥐의 정소상체의 지방체에서 지방 세포를 배출하는 능력을 검사합니다⁵. 그런 다음, 지방 세포는 인슐린 첨가 유무에 관계없이 포도당 산화율을 측정하여 대사 활성을 검사합니다. Type IV(C5138, C1889) 및 Type VIII(C2139)로트는 쥐의 간에서 생균 세포를 배출하는 능력을 위해 여러 가지가 테스트되었습니다⁷. Type V(C9263, C2014), Type XI(C7657, C4785, C9407 및 C9697) 및 Type S(C6079) 콜라겐 분해효소 로트는 제품 쥐 췌장에서 손상되지 않은 랑게르한스 섬을 배출하는 테스트를 통과해야 합니다⁸.

콜라겐 분해효소 조직 소화/해리 문제 해결 및 참조

당사의 자체 연구 개발과 고객과의 논의를 바탕으로 특정 조직을 해리하고 제조하는 방식이 콜라겐 분해효소와 관련된 조직 소화 분해의 속도와 효율성에 상당한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었습니다. 조직 기증자의 연령 차이도 시간에 대한 주요 변동 원인이 될 수 있습니다. 칼슘 이온이 5 mM의 소화 버퍼에 존재하는지 확인해야 합니다. 킬레이트 시약 EGTA와 EDTA는 효소의 안정성과 활성에 필요한 칼슘 이온을 제거함으로써 콜라게 분해효소의 활성을 크게 억제할 수 있습니다. β-mercaptoethanol¹⁶, 시스테인¹⁶ 및 8-hydroxyquinoline-5-sulfonate¹⁶은 서로 다른 억제 물질입니다. 더 높은 특이 활성을 가진 새로운 콜라겐 분해효소는 정해진 농도에서 과도한 세포사(cell death)를 일으킬 수 있습니다. 이 경우 콜라겐 분해효소를 적게 사용하거나 BSA 또는 혈청(각각 최대 0.5 % 및 5~10 %)을 추가하여 세포가 더 잘 소화되도록 안정화합니다.

문제	원인	해결책	참조문헌
소화불량	비활성 효소 부적합 Ca++ 효소 불충분	콜라겐 분해효소를 차가운 곳에 건조한 상태로 보관하십시오. 콜라겐 분해효소 용액을 냉동 알리코트에 보관하십시오. 콜라겐 분해효소 용액에 5 mM Ca++를 추가합니다. 콜라겐 분해효소 더 많이 사용합니다. 더 많은 단백질 분해효소 활성과 혼합해 보십시오.	6 7
배출 세포가 갇힘	해체된 세포에서 배출된 DNA 부적합 비단백질 검	소요 감소 DNAse** 추가 소화하기 전에 조직을 잘 씻어냅니다*** 소화액에 Mg++를 사용하지 마십시오 효소에 히알루로니다아제 추가**	7 9 7 7 18
세포가 죽음	과도한 단백질 분해효소 pH 변화 산소 부족	단백질 분해효소에 대한 노출 감소* 알부민 또는 가열혈청 추가 HCO-3 대신 버퍼(예: HEPES) 사용. 자주 pH 확인 및 재조정 소화액 가스 첨가(공기 또는 O2) 효소를 더 많이 사용하여 소화 속도 높임	7 19
세포 수율 낮음	효소 균형 부착 계수	콜라겐 분해효소 더 많이 사용* 콜라겐 분해효소에 엘라스타제 포함** Ca++제거를 위해 조직 관류***	20 7
많은 세포 손상	과도한 단백질 분해효소 물리적 손상	단백질 분해효소 적게 사용* 알부민 또는 가열 혈청 추가 조직과 세포를 매우 부드럽게 취급	21 7
새로운 로트가 반응하지 않음	로트 변동	분할된 콜라겐 분해효소 “blends” 사용(제품 번호 C7926, C8051 또는 C8176)*

* "Blend" 제품(번호 C7926, C8051 또는 C8176)에 별도로 제조된 콜라겐 분해효소 및 단백질 분해효소는 각각이 얼마나 사용되는지에 대한 재현 가능한 제어를 제공합니다.

** DNAse는 과도한 교반에 의한 전단 현상으로 비활성화되고, 첨가된 효소는 콜라겐 분해효소에 존재하는 중성 단백질분해효소에 의해 소화될 수 있습니다.

*** EGTA(또는 EDTA)를 사용하여 Ca++를 제거하고 미생물을 씻어낸 후 버퍼로 조직을 세척하여 킬레이트 시약을 제거합니다. 효소 용액에 EGTA 또는 EDTA를 첨가하지 마십시오!

참고문헌

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