Auto2D^® 자동 2D 겔 전기영동 기기

2D 겔 전기영동은 어떻게 작동합니까? SDS-PAGE 같은 1차원 단백질 겔 전기영동법 기술은 실험실에서 일상적으로 수행되며, 이러한 방법은 분리능이 낮습니다. 2차원 겔 전기영동법(2-DE)은 복합체 시료에서 단백질을 등전점(pI) 값 및 분자량으로 분리하며, 수백 개 또는 수천 개에 이르는 단백질을 높은 해상도로 직접 비교할 수 있습니다. 분석 소프트웨어, 면역검출 또는 질량분석법과 병행하면, 2-DE는 단백질 식별 및 기타 단백질체 분석을 돕는 강력한 도구가 됩니다. 추가적인 자료 및 제품을 보려면, 단백질 전기영동 및 웨스턴 블로팅 페이지를 방문하십시오.

• 완전 자동화 2D 겔 전기영동법
• Auto2D^® 2D 전기영동 기기를 사용하여 2D 겔을 어떻게 실행하십니까?
• 2D 겔 전기영동을 왜 사용할까요?
• 바이오의약품에서 잔류 HCP 측정
• ELISA 및 기타 면역분석용 Anti-HCP 항체 검증을 위한 Auto2D^® 시스템
• Auto2D^® 시스템의 높은 재현성
• 항원 프로파일링을 위한 Auto2D^® 시스템
• 규제 요구 사항 준수를 위한 Auto2D^® 시스템

 

완전 자동화 2D 겔 전기영동법

2차원 겔 전기영동은 일반적으로 수행하기 어렵고 시간 소모적으로 여겨지며, 고급 사용자 교육이 필요할 뿐만 아니라 재현성이 낮고 작업자 간 실험 결과의 변동성이 높습니다. Auto2D^® 시스템은 2차원 겔 전기영동을 완전 자동화합니다. 적용된 시료는 1차원 겔에 확산에 의해 흡수되며, 단백질을 등전점에 따라 분리합니다. 평형화를 완료한 1차원 겔은 단백질의 분자량에 따라 분리되는 수평으로 놓인 SDS-PAGE 겔 위에 배치됩니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 사용자 친화적이며, 2차원 전기영동이 1~2시간 만에 더 빠르면서도 더 재현성 있는 결과를 낼 수 있도록 합니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기의 추가적인 특징 및 이점은 다음을 포함합니다.

• 사용하기 쉽고, 고급 교육이 필요 없음
• 빠른 워크플로 구현으로 실험 중지 시간 감소
• 작업자 간 변동성을 낮추고 재현성은 높임
• GMP 준수를 위한 IQ/OQ 지원

Auto2D^® 2D 전기영동 기기를 사용하여 2D 겔을 어떻게 실행하십니까?

Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 2차원 겔 전기영동을 완전 자동화하고, 단백질 분석을 간소화하며, 더 일관성 있고 재현성 있는 사용자에 의존하지 않는 결과를 제공합니다. Auto2D^® 시스템의 효율적인 엔지니어링은 시료 로딩, 등전점 전기영동, 평형화, SDS-PAGE 등 일련의 과정에서의 소요 시간을 4~24시간에서 불과 1~2시간까지 크게 감소시킵니다. 이는 Auto2D^® 기기가 시중의 다른 반자동 2-DE 시스템과 차별화되는 장점입니다.

그림 1. Auto2D® 기기에 의해 자동화된 2차원 겔 전기영동 워크플로 및 단계.

2D 겔 전기영동을 왜 사용할까요?

Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 수많은 분야에서 입증되었습니다. 적합한 사용 사례로는 암 연구에서의 차등단백질발현 분석 및 질병기전의 해명이 있습니다. 또한 결정화 또는 번역 후 변형(PTM) 분석을 위해 정제 단백질을 분리할 때 사용하거나, 알레르기 연구 또는 세포 신호전달경로 분석 같은 연구 분야에서도 2D 웨스턴 블로팅을 위해 사용할 수 있습니다.

그림 2. 왼쪽: 암 생체표지자 연구를 위해 배양된 세포에서 차등 단백질 발현 분석. 녹색은 정상 세포에서의 더 과다한 단백질을 나타냅니다. 빨간색은 암 특이적 단백질 부분을 나타냅니다. 노란색은 단백질 발현에서의 중복을 나타냅니다. 오른쪽: 혈장 시료에서의 차등 단백질 발현.

그림 3. 왼쪽: 치료용 항체 완제의약품에서의 미세한 이질성 평가. 빨간 삼각형은 표적 항체 부분을 나타냅니다. 아래쪽 부분은 항체가 없는 부위입니다. 오른쪽: 정제 전/후 단백질 분석. 2-DE는 결정화 및 X-선 구조 분석을 위해 시료가 균질한 지 여부를 확인하는 용도로 사용할 수 있습니다.

그림 4. SDS-PAGE로 분석한 밀 추출 단백질(SYPRO Ruby로 검출) (A), WB: SDS-PAGE로 분석한 항글리아딘 항체 (B), SDS-PAGE로 병합 (C). 밀 추출 단백질(SYPRO Ruby로 검출), 화살표는 항글리아딘 항체로 검출된 부분을 나타냅니다(D). 항글리아딘 항체를 사용한 WB (E), 병합 (F).

바이오의약품에서 잔류 HCP 측정

2D 겔 전기영동은 치료용 단백질 분석 및 항체 바이오공정에서 오염된 숙주세포단백질(HCP) 분석에도 적합합니다. 생물제제 제조 공정에서 유입된 잔류 HCP 불순물은 환자에게 면역원성 반응을 유발하고 약물 효능을 감소시킬 수 있습니다. 규정을 준수하려면 안전성을 보장하기 위해 허용 가능한 수준으로 HCP를 모니터링하고 제거하는 것을 필요로 합니다. 일본, 유럽, 미국 약전에서는 바이오의약품 제품 제조를 위해 HCP 분석의 개발 및 검증을 위한 지침을 발표하였습니다.

규정 준수를 충족하기 위해 HCP 분석은 모든 분석 성분의 철저한 적격성 평가와 함께 체계적으로 개발되어야 합니다. 항체 검증에 있어서, 포괄적인 HCP 적용범위를 보장하기 위해 2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(2D-PAGE)이 필요합니다. 2D-PAGE를 포함한 겔 전기영동은 다클론항체 제품을 위한 교정 표준 또는 면역원으로서 사용되는 항원의 특성화에도 권장됩니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 고급 사용자 교육이 필요 없으며, 바이오공정 워크플로에서 실행을 용이하게 하여 산업 표준 준수를 충족시킵니다.

ELISA 및 기타 면역분석용 Anti-HCP 항체 검증을 위한 Auto2D^® 시스템

ELISA는 HCP 분석을 위한 가장 일반적인 분석 포맷입니다. 이 면역분석법은 잔류 HCP를 광범위하게 인식하는 다클론항체를 필요로 합니다. 일본 및 유럽 약전은 HCP 항체 적용범위를 평가하기 위해 2D 겔 전기영동 후에 웨스턴 블로팅 분석(2D 웨스턴 블로팅)의 사용을 명시하고 있습니다. 미국 약전은 항체 적용범위를 평가하기 위해 2D 웨스턴 블로팅 분석 또는 면역친화 정제 후에 겔 전기영동의 사용을 명시하고 있습니다.

그림 5. 상업적 공급원에서 얻은 Cy3 표지된 CHO HCP 항원 20 μg을 pH 3~10 IEF 칩 및 12.5% PAGE 칩을 사용하여 Auto2D^® 시스템 상의 2D 겔 전기영동으로 분리하였습니다(A). 이후 단백질을 멤브레인으로 옮기고, 2개의 각기 다른 anti-HCP 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였습니다(B, C). 데이터는 anti-HCP 항체 1이 anti-HCP 항체 2에 비해 숙주 세포 단백질의 적용범위가 더 넓은 것을 나타냅니다.

Auto2D^® 시스템의 높은 재현성

일관되고 재현성 있는 공정은 생물제제 제조 및 품질관리에 필수적입니다. 더 빠른 결과 및 더 높은 처리량과 더불어, 완전 자동 Auto2D^® 겔 전기영동 시스템은 2D-PAGE 및 2D-DIGE 방법에서 일별 변동성 및 작업자 간 변동성을 제거하며, 더 신뢰성 있는 결과를 위해 유의미하게 향상된 재현성을 제공합니다.

그림 6. 상업적 공급원에서 얻은 Cy5 표지된 CHO HCP 항원 0.75 μg을 2D 겔 전기영동으로 분리하고, IEF 칩 pH 3~10NL 및 12.5% PAGE 칩을 사용하여 Auto2D^® 시스템에서 분석하였습니다. 동일한 시료가 총 3회 측정되었습니다(A~C). 하얀 부분(D)은 결과의 중첩을 보여줍니다. 데이터는 Auto2D^® 시스템을 이용한 2차원 겔 전기영동의 높은 재현성을 시사합니다.

항원 프로파일링을 위한 Auto2D^® 시스템

ELISA 및 기타 면역분석용 다클론항체 풀을 획득하기 위해서는 HCP 항원을 이용한 면역화가 필요합니다. HCP 항원은 검출 및 계량을 위한 교정 표준으로서도 사용됩니다. 공정 특이적 HCP 항원은 형질주입되지 않은 무표지 세포 배양으로부터 만들어집니다. 이러한 항원은 HCP의 패턴을 보이고, 광범위한 단백질 존재를 확인하도록 특성화되어야 하며, 무표지 세포 배양으로부터 얻은 HCP 항원이 생산 배양에서 얻은 항원을 대표할 수 있어야 합니다. 일본, 유럽, 미국 약전은 항원 특성화 및 프로파일링을 할 때 SDS-PAGE 또는 2D 겔 전기영동의 사용을 권장합니다. 또한 미국 약전은 잔류 HCP 모니터링을 상호 보완하는 방법으로서 2D 겔 전기영동을 사용하는 것을 제안합니다.

그림 7. Cy3 표지된 비정제 CHO HCP 항원 및 Cy5 표지된 단백질 A로 정제된 CHO HCP 항원의 혼합물은 Auto2D^® 시스템을 사용하여 2차원 차등 겔 전기영동(2D-DIGE)에 의해 분리 및 분석되었습니다(A~B). 병합된 데이터에서 붉은 부분(C)은 단백질 A를 이용한 정제 이후에도 남아있는 숙주세포단백질(HCP)을 나타냅니다. 이 데이터는 정제 후 잔존하는 숙주세포단백질(HCP)의 프로파일링을 위해 Auto2D^® 시스템을 사용할 수 있음을 보여줍니다.

규제 요구 사항 준수를 위한 Auto2D^® 시스템

Auto2D^® 시스템은 바이오의약품 제조에서 HCP 분석을 위한 규제 요건을 준수하도록 지원합니다. 이 완전 자동화 시스템은 일별 변동성 및 작업자 간 변동성을 제거하여, 신뢰성 있는 결과를 얻는 데 2시간도 걸리지 않습니다. 바이오공정 워크플로에서 실행을 용이하게 하는 Auto2D^® 시스템은 생산 변경과 관련된 실험 중지 시간을 감소시킵니다. HCP 분석을 위한 외주가 필요 없고 사내에서 분석을 진행하므로 지적 재산을 보호할 수 있습니다. 추가적인 제품 및 자료를 원하시면 단백질 전기영동 및 웨스턴 블로팅 허브 페이지를 방문하십시오.