아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 전달 시스템은 백신 및 유전자 요법으로 사용되는 벡터 면역원성으로 확립되고 승인되었습니다. 널리 사용되고 있음에도 불구하고 이러한 바이러스 전달 시스템은 다른 방식보다 면역원성과 더 잦은 전신 부작용을 유발할 수 있습니다. 또한 제조 공정이 복잡할 수 있으며 유전자 치료 응용분야에서는 높은 역가가 필요합니다.
이와는 대조적으로 비바이러스 전달 시스템은 더 나은 안전성 프로파일을 가질 것으로 예상되며 단순화된 제조로 템플릿 공정의 가능성을 제공합니다.
mRNA 기술은 비바이러스 전달 시스템을 사용하며 매우 다양한 기능을 제공합니다. mRNA를 세포의 시토졸에 전달하면 치료 또는 예방 기능을 할 수 있는 표적 단백질의 생성을 유도할 수 있고, 백신 접종 목적인 면역 반응을 유발하는 항원으로 작용할 수 있으며, 결함이 있는 단백질을 대체하거나 항종양 반응을 활성화할 수 있습니다.
SARS-CoV-2에 맞선 3종 mRNA 백신의 강력한 초기 성과는 현재의 대유행을 뛰어넘는 의미를 가지며, 종양, 심장 질환 및 기타 전염성 질환과의 싸움에서 채용할 수 있는 유사한 접근 방식이 될 수 있습니다.
mRNA 제조에 대한 고려사항
치료제와 백신으로의 사용을 위한 mRNA의 개발과 제조는 비교적 간단하고 확장 가능하며 매우 빠릅니다(그림 1). 개발에서 임상 및 승인까지의 기간 단축으로 mRNA 기술은 전염성 질환 및 대유행 발병에 대한 대응 뿐만 아니라 미충족 수요가 있는 질환에 대한 새로운 치료적 접근 방식의 개발에도 매력적이라 할 수 있습니다.
mRNA는 효소 과정을 통한 시험관 내 합성에 의해 생성되며, 이는 많은 시간이 소요되는 복제 및 증폭 단계가 필요한 기존의 생체 내 단백질 발현과 대조됩니다. 시험관 내 합성 공정을 사용하기 때문에 세포 또는 숙주 세포 단백질을 제거할 필요가 없습니다. 모든 대상에 동일한 반응 물질과 용기를 사용하는 이 단순화된 제조 공정은 GMP 설비가 공정 및 제형에 대한 최소한의 적응으로 매우 짧은 시간 내에 새로운 단백질 표적으로 전환할 수 있게 합니다.
그림 1.mRNA 제조를 위한 일반 공정의 개요.
mRNA 제조
mRNA 기반의 치료제와 백신의 생산 은 일반적으로 DNA 의존적 RNA 중합효소 촉진자와 mRNA 구조에 해당하는 서열을 포함하는 pDNA 템플릿으로 시작합니다. pDNA 구조의 주요 역할을 감안할 때, 설계와 순도는 mRNA 제품을 최적화하는 데 중요한 요소입니다. pDNA 생산 및 정제에는 핵산의 큰 크기와 높은 점성도, 전단 민감도 및 pDNA와 불순물 간의 유사성으로 인한 여러 어려움이 존재합니다. 이러한 어려움을 극복하기 위한 전략은 ‘플라스미드 DNA의 확장 가능한 정제’라는 제목의 당사 웨비나에서 다루고 있습니다.
mRNA 구성은 관심 유전자의 효율적인 발현을 보장하도록 설계되었습니다. 안정성, 유전자 발현 및 효율적 단백질 번역은 몇 가지 구조적 요소에 따라 달라집니다(그림 2).
그림 2.mRNA 구조.
- 서열의 5’ 말단에 있는 캡 영역은 mRNA 성숙에 필수적이며 효율적인 단백질 번역을 위해 리보좀이 mRNA를 인식할 수 있도록 합니다. 캡은 뉴클리아제 소화로부터 mRNA를 보호하여 이를 안정화합니다.
- mRNA 코딩 영역의 배양 및 정제 도메인에 위치한 미번역 영역(UTR)은 번역 효율, 국소화 및 안정성에 영향을 미치며 효율적인 단백질 발현에 사용될 수 있습니다.
- 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열 영역은 관심 유전자(GOI)를 포함하고 있습니다.
- 폴리-(A) 테일은 3’ 엑소뉴클레아제에 의한 소화를 방지하여 단백질 번역 및 mRNA 안정정에 중요합니다.
필요한 pDNA는 박테리아 세포, 일반적으로 대장균 내에서 증폭되고 후속 정제 단계는 순수하고 농축된 원형 pDNA를 생성합니다. pDNA는 원하는 mRNA를 전사하기 위한 RNA 중합 효소의 템플릿 역할을 할 수 있도록 선형화됩니다.
제거해야 할 추가 불순물로 이어지는 원하지 않은 형태의 mRNA를 생성할 수 잇는 전사 판독 사례를 피하기 위해 선형화가 필요합니다. 반응 버퍼4에서 플라스미드 DNA를 제한 효소와 혼합하고 이후 4시간 동안 37 °C에서 배양하여 선형화를 달성합니다. 선택적으로 EDTA를 첨가하거나 65 °C에서 열 불활성화를 통해 반응을 중단합니다.
제한 효소, BSA, DNA 단편, 내독소 및 기타 불순물이 제거됩니다. 실험실 규모 프로세스의 대부분은 용매 추출 기술을 사용하여, 이는 GMP 생산 환경에는 적용되지 않습니다.
대안으로 Tangential flow filtration(TFF)과 크로마토그래피는 이러한 정제 단계를 위한 효율적인 불순물 제거 기술입니다.
다음 단계는 DNA 템플릿으로 사용되는 선형화된 pDNA가 mRNA로 전사되는 시험관 내 전사입니다. 이 효소 반응은 RNA 중합 효소와 뉴클레오티드 삼인산을 포함한 자연 전사 과정의 요소를 사용합니다. 전사 이후 최종 mRNA 구조는 세포의 안정성과 효율적 형질 도입을 위해 5’ 캡 구조가 필요합니다.
캡은 공동 전사적 또는 효소적 방법의 두 가지 방법으로 추가할 수 있습니다. 공동 전사 캡핑은 일반적으로 하나의 GTP에 대해 4개의 캡 유사체의 비율로 전사 혼합물에 캡 유사체와 구아노신 삼인산(GTP)을 추가하여 수행합니다. 37 °C에서의 배양 단계 후, DNA 템플릿은 일반적으로 DNase의 추가에 의해 분해되며, 생성된 작은 DNA 단편은 Tangential flow filtration(TFF)을 통해 더 큰 mRNA 분자로부터 쉽게 분리될 수 있습니다. DNA 템플릿을 제거하는 또 다른 옵션에는 크롬 단계의 활용이 포함됩니다(예: 폴리(dT)포획). 후자의 경우, DNA 템플릿을 소화할 필요가 없어 작은 DNA 단편이 mRNA에 혼성화될 수 있는 위험을 피할 수 있습니다.4
공동 전사 캡핑은 동일한 반응기 믹스에서 전사 단계 동안 수행되기 때문에 효소 캡핑보다 저렴하고 빠릅니다. 그러나 효율과 수율은 더 낮고 GTP가 캡 유사체 대신 mRNA 서열에 결합할 수 있기 때문에 캡핑되지 않은 불순불이 발생할 수 있습니다. 또한 캡 유사체는 반대 방향으로도 결합될 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 일부 ARCA(anti-reverse cap analogs)가 개발되어 이러한 5’ 캡의 역결합을 방지하여 번역 효율성을 높였습니다.
효소 캡핑은 시험관 내 전사 혼합물로부터 mRNA를 정제한 후에 수행됩니다. 이 반응은 mRNA 구조에 캡핑 구조를 추가하기 위해 일반적으로 백시나아 바이러스 캡핑 효소를 사용합니다. 효소적 캡핑은 캡핑 효율이 매우 높지만 비용이 더 많이 소요되고 추가 단위 작업이 필요합니다.
mRNA 정제
시험관 내 전사 단계 후 내독소, 면역성 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 DNA 템플릿, RNA 폴리메라제, 원소 불순물을 포함하여 이전 단계에서 사용된 불순물과 물질로부터 mRNA를 정제합니다. mRNA 정제에 사용할 수 있는 몇 가지 옵션이 있습니다.
TFF는 mRNA를 멤브레인에 의해 제거되지 않은 작은 불순물로부터 효율적으로 분리하며, 30~300 kDa 범위의 분자량 컷오프를 mRNA 크기에 따라 사용할 수 있습니다. TFF를 사용하면 동일한 단위 생산 내에서 제품을 정제, 농축, 정용여과할 수 있습니다. 이 단계에서 mRNA는 효소 캡핑이나 크로마토그래피를 위해 적절한 버퍼 내에 있어야 합니다. 그러나 TFF를 사용 시의 중요한 고려사항은 작은 DNA 단편이 mRNA에 혼성화되어 추가 불순물을 생성할 수 있다는 점입니다. 앞서 본 것처럼 포획을 사용하여 DNA 템플릿을 제거하는 경우 이러한 위험은 없습니다.5
역상 이온쌍, 음이온 교환, poly(dT) 캡처를 사용한 친화 크로마토그래피 등을 포함한 많은 크로마토그래피 기법을 TFF의 대안으로 사용할 수 있습니다(표 1).
표 1.mRNA 정제를 위한 역상 이온쌍, 음이온 교환 및 친화 크로마토그래피의 비교. DBC: 동적 결합 능력(dynamic binding capacity).3,4
크로마토그래피는 DNA 템플릿 제거를 위한 효율적인 수단을 제공하고 한외여과/정용여과 단계에서 발생할 수 있는 혼성화의 위험을 제거합니다. 그러나 이는 더 많은 비용이 소요되며 배지 교환 및 후속 단계 준비를 위해 TFF 단계는 여전히 필요합니다.
크로마토그래피는 이전의 효소 반응 단계에서 발생하는 원치 않는 산물과 올리고뉴클레오티드 불순물을 제거하기 위해 효소 캡핑 단계 이후에도 사용됩니다.
역상 이온쌍은 일반적으로 소규모에 사용되며 매우 효율적이고 신속하게 RNA를 정제하고 DNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 짧은 전사체로부터 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 분리합니다. 그러나 이러한 방법은 용매를 사용하므로 GMP 제조 생산에는 적합하지 않습니다. 또한 이 기술은 이온쌍 시약이 필요하며 mRNA와의 복합체 형성은 제거를 위한 광범위한 정용여과 단계가 필요할 수 있습니다. 또한 단백질 및 응집체에 의한 오염 민감도로 이 기술은 포획보다는 연마에 더 적합합니다.
음이온 교환은 높은 동적 결합 능력을 가지며 dsRNA, 캡핑되지 않은 RNA, RNA-DNA 하이브리드 및 기타 RNA 구조와 같은 면역원성 불순물을 제거하는 데 매우 효율적입니다. 이는 수용액의 사용을 허용하지만 수지에 결합된 큰 mRNA 분자를 탈리하기 위해 독성이 있을 수 있는 소수성 제제의 추가와 최대 85 °C의 온도에서의 작업이 필요할 수 있습니다. 주변 온도 작업은 일반적으로 500개의 염기보다 작은 mRNA 종을 용출합니다.3
친화성 크로마토그래피 폴리(dT) 포획은 전장 mRNA 전사체의 폴리(A) 테일을 구체적으로 포획하기 위해 수지를 사용합니다. 이 공정은 DNA, 뉴클레오티드, 효소, 완충제 성분 및 폴리(A) 테일이 없는 기타 불순물을 효율적으로 제거합니다.
이 기술의 단점은 역상 및 음이온 교환과 달리 dsRNA를 ssRNA와 구별할 수 없다는 점입니다. 또한 제품 관련 폴리(dT)는 mTNA에 혼성화된 DNA 단편과 같은 다른 제품 관련 불순물을 제거하는 데에는 효율적이지 않습니다. 이러한 이유로 초기 크로마토그래피 단계는 친화 크로마토그래피이며 이후 연마 목적으로 음이온 교환을 사용하는 이차 크로마토그래피 단계로 이어집니다.
크로마토그래피 단계 이후 최종 농축 및 정용여과를 수행하여 제품 순도를 극대화하고 제제화 또는 보관을 위해 mRNA를 적절한 버퍼로 전달합니다. 이 단계에서는 동일한 단위 생산 내에서 mRNA를 추가로 정제, 농축, 정용여과할 수 있습니다. 멸균 여관 단계는 TFF 단계 이후에 수행할 수 있습니다. 그러나 분자량이 5000 kDa 이상인 일부 mRNA의 멸균 등급 여과는 어려울 수 있습니다.
mRNA 제제화
전달 도구는 mRNA 백신 및 치료제의 효과에 동등하게 중요합니다. 최종 mRNA 정제 단계 이후의 고려사항은 전달 메커니즘입니다(그림 3). 가장 발전된 종류의 전달 시스템 중 하나는 지질과 고분자의 조합입니다. 여기에는 리포플렉스를 형성하는 지질에 결합된 올리고뉴클레오티드의 복합체 또는 폴리플렉스를 형성하는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양전하 고분자가 포함됩니다.
지질 나노입자(LNP)는 mRNA 전달에 가장 일반적으로 사용되며, 각 지질 나노입자는 mRNA를 운반하고 분해로부터 보호할 수 있는 네 가지 지질로 구성됩니다.
양이온성/이온성 지질은 정전기 상호작용을 통해 RNA를 캡슐화하는 데 필요합니다. 간세포로의 전달(단백질 발현의 촉진 또는 억제하기 위해)은 이온화가 가능한 지질(수동적 표적화, 엔도좀 방출)이 필요한 반면 면역 세포에 의한 흡수가 훨씬 쉽습니다. 또한 이는 강력한 양이온성 지질에도 작용합니다.
그림 3.여러 mRNA 전달 시스템을 이용할 수 있습니다.
또한 이러한 지질은 세포질로 RNA를 효율적으로 방출하는 역할을 합니다. 양이온 지질의 구조는 LNP 활성과 그 독성 및 생체 분포에 큰 영향을 미치며, 이는 체내에 잠재적인 독성 효과에 영향을 미칩니다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질은 콜로이드 안정성을 제공하고 입자에 단백질 결합을 방지하여 면역 체계로부터 보호하고 순환이 더 길어지게 합니다. PEG 사슬과 지방산 사슬의 길이는 순환의 수명과 융합성 또는 입자가 LNP의 엔도좀 멤브레인과 얼마나 잘 융합할 수 있는지 결정합니다. 순환의 연장이 목표인 경우, 폴리에틸렌 글리콜디스테아로일글리세롤(DSG PEG 2000)과 같은 더 긴 지방산 사슬을 사용할 수 있습니다. 또한 PEG 농도는 입자의 크기에 영향을 미칩니다. 또한 PEG의 사용으로 항체가 형성되어 잠재적으로 예방접종을 무용지물로 만들 수 있습니다.
중성/음이온성 지질은 구조적 안정성을 제공하고 융합성 및 생체 분포를 정의하는 역할을 합니다. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine. 예를 들어, 최근 연구1에서 엔도좀 방출에 중요한 역할을 하는 DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine)를 함유하는 LNP가 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)에 비해 간으로의 mRNA 전달을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 최근 연구2에 따르면 이러한 보조 지질이 RNA의 안정적인 캡슐화에도 도움이 됩니다.
콜레스테롤은 LNP의 이중층 밀도, 유동성 및 흡수(뗏목 형성)를 조절하는 데 사용됩니다. 동물 유래 버전과 합성 버전의 콜레스테롤을 시중에서 구할 수 있지만, 합성 콜레스테롤은 고순도, 프리온과 같은 동물 유래 분자의 부재, 확장성 및 일관성 높은 품질을 포함한 여러 이점을 제공합니다.
지질 선택에서의 고려사항 지질은 최대 효능과 최적의 생체 분포를 달성을 염두에 두고 전달 경로를 바탕으로 선택해야 합니다. 지질 선택 외에도 개별 지질 간의 비율은 LNP의 이중층 유동성과 융합성에 직접적인 영향을 미치므로 미세 조정의 중요한 구성 요소입니다.
지질을 선택할 때 여러 중요한 측면을 고려해야 합니다. 지질 유형, 소스 및 품질은 불순물 프로파일에 직접적인 영향을 미치며 입자 특성, 안정성 및 방출 프로파일과 같은 성질이 최종 제제화 공식입니다. 최종 제제화 공식으로 재현 가능한 결과를 얻기 위해 지질 합성에 사용되는 원료의 품질과 지질 자체의 적절한 물질 특성에 따른 지질의 일관된 품질을 필요합니다.
정제된 mRNA는 여러 기술을 통해 전달 입자로 제형화될 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 용매 주입 기술에서 지질을 에탄올과 같은 용매에 용해하여 직교류 혼합 또는 미세유체 혼합을 사용하여 mRNA를 함유하는 pH가 낮은 수성 버퍼에 빠르게 혼합해 LNP를 생성합니다. pH가 낮은 버퍼를 중성 버퍼로 정용여과한 후 한외여과를 사용하여 입자를 농축합니다.
지질은 낮은 pH에서 가수분해되어 지질 이중층 구조, 제형의 안정성 및 약물 방출 특성에 영향을 미칠 수 있는 가수지질과 같은 불순물이 형성될 수 있으므로 TFF 단계는 신속하게 진행해야 합니다. 지질의 분해는 입자의 크기를 증가시켜 응집을 일으킬 수 있습니다.
LNP는 다른 전달 시스템에 비해 안정성과 구조적 가소성 및 향상된 유전자 전달이 매우 우수합니다. 네이키드 mRNA에 비해 트랜스펙션 속도를 증가시켜 혈류에 존재하는 RNase에 의한 분해 위험 없이 정맥주사를 가능하게 하고 특정 리간드가 통합된 경우 활성 표적화를 가능하게 합니다.
LNP의 단점은 콜드체인 물류체계가 필요할 수 있다는 사실입니다. 또한 LNP를 사용한 멸균 여과가 항상 가능한 것은 아니며, 이러한 경우 감마선 조사, 가열 멸균, 고압 멸균 또는 격리 처리와 같은 대체 방안을 고려해야 합니다.
mRNA 제제화와 관련 주요 파라미터 및 고려사항에 대한 자세한 내용은 다음의 당사 웨비나를 참고하십시오. ‘지질 기반 RNA 전달을 위한 성공적인 제제 개발의 열쇠.’
확장 시 고려사항
mRNA 제조 공정을 확장할 때 염두에 두어야 할 여러 고려사항이 있으며, 소규모 작업 시 공정 개발 중 이러한 사항을 최우선으로 고려해야 합니다.
- mRNA 정제를 위한 용매 추출 및 침전 단계를 사용하는 방법은 확장이 어렵고 유해 용매의 사용은 GMP 환경에 적합하지 않으며 TFF 또는 크로마토그래피로 대체할 수 있습니다.
- mRNA는 RNase에 의해 몇 초 안에 분해될 수 있기 때문에 제품과 접촉하는 모든 원료, 용액 및 장비에는 이러한 효소가 없어야 합니다.
- 적절한 전달 시스템은 백신 또는 치료제의 효율성에 기여하므로 신중하게 선택해야 합니다.
- 최종 제품이 큰 mRNA 복합체인 경우 제품의 멸균 여과에 대한 대안을 평가해야 합니다.
- 특별한 공급망 요건(예: 콜드체인)은 비용을 유발하는 요인입니다. 따라서 약물의 안정성을 신중하게 평가해야 합니다.
밝은 미래
mRNA 기술은 전례 없는 속도와 뛰어난 효율로 COVID-19 백신 후보물질의 개발을 가능하게 했습니다. 앞으로 이 기술은 질병 발생에 대한 신속 대응을 가능하게 하여 백신 개발 분야에 대혁신을 일으킬 뿐만 아니라 유전자 치료 접근법으로 의학적인 미충족 요구가 있는 질병을 해결하는 데 도움이 될 것입니다.
mRNA는 빠르고 유연한 백신 플랫폼이 될 잠재력이 있습니다. 백신 개발은 이제 과학적 도전이 아닌 공정 개발에 초점을 맞출 수 있습니다. 기업들은 병원체의 유전자 서열을 알게 되면 mRNA 백신을 비교적 빠르게 설계할 수 있습니다. 이러한 치료적 접근 방식이 최대한의 잠재력을 발휘할 수 있도록 하기 위해 혁신적인 솔루션, 전문지식 및 독창성을 모두 합쳐 생산 규모의 간단하고 강력한 플랫폼을 구축해야 합니다. 개발된 mRNA 구성체와 전달 시스템의 안전성, 효율성, 품질 및 제조 가능성과 관련된 문제들도 평가해야 합니다.
이러한 문제들이 해결되면 mRNA 기반의 백신 및 치료제는 전 세계 환자들에게 놀라운 결과를 제공하는 고급 방식 중의 하나로 자리잡을 것입니다.
참고문헌
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