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형광 수명 측정

소개

FLT(형광 수명)란 형광단이 광자를 방출하고 기저 상태로 돌아가기 전에 자극 상태에서 보내는 시간입니다. FLT는 형광단에 따라 피코초에서 수백 나노초까지 다양합니다.

형광 모집단의 수명은 형광 또는 비발광 과정을 통해 발생한 에너지 손실로 원래 모집단의 N/e(36.8 %)까지 기하급수적으로 붕괴되는 자극 상태의 분자 수를 측정한 시간입니다.

형광 수명은 형광단의 본질적인 특성입니다. FLT는 형광 농도, 시료에 의한 흡수, 시료 두께, 측정 방법, 형광 강도, 광 표백 및/또는 자극 강도와는 관계가 없습니다. 온도, 극성, 형광 퀜처의 존재와 같은 외부 요인의 영향을 받습니다. 형광 수명은 형광단 구조에 의존하는 내부적 요인에 민감합니다.1

형광단의 형광 수명을 결정하는 방법

형광 수명은 주파수 도메인 또는 시간 도메인에서 측정할 수 있습니다.

시간 도메인 방법에는 짧은 빛의 펄스를 가진 시료(커벳, 세포 또는 조직)의 조도가 포함되며, 뒤이어 시간에 대한 방출 강도를 측정합니다. FLT는 붕괴 곡선의 기울기에서 결정됩니다. 수명 측정에는 여러 형광 검출 방법을 사용할 수 있으며, 이 중에서 TCSPC(시간 상호 관련 단일 광자 계산)를 통해 간단한 데이터 수집과 향상된 정량적 광자 계산이 가능합니다.

주파수 영역 방법은 높은 주파수에서 입사 광선의 사인파 변조를 포함합니다. 이 방법에서 방출은 위상 지연을 수반한 입사 광선과 동일한 주파수로 발생하며 자극광(변조)에 비례하여 진폭의 변화를 동반합니다.

강도 기준 측정 대비 형광 수명 측정의 장점2

  1. 수명 측정에는 많은 분석물의 정량적 결정을 위해 파장에 대한 입출력 비례 시스템을 갖는 프로브가 필요하지 않습니다.
  2. 수명 측정법은 스펙트럼 시프트가 있는 프로브를 사용하여 분석물 농도 범위의 감도를 확대하는 방법입니다.
  3. 수명 측정은 직접 프로브가 없는 분석물에 사용할 수 있습니다. 이러한 분석물은 포도당, 항원을 포함하며 형광 에너지 전달 메커니즘에 기초한 친화력 또는 면역분석을 포함합니다.

응용분야

형광 수명 분석:

형광 수명은 여러 생물학적 분석에 사용하기 위한 강력한 매개 변수입니다. 흡수, 발광 또는 형광 강도와 같은 전통적인 측정 기법을 대체할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.3 형광단의 물리화학적 환경의 변화는 형광 수명의 변화를 일으킵니다. 수명 기반 분석은 FLT의 변화를 가져오기 위해 두 구성 요소의 결합을 포함하는 간단한 결합 분석(형광 표식이 한 개)과 같은 다양한 메커니즘을 활용하여 개발될 수 있습니다. 또 다른 메커니즘에는 적지만 유한한 형광을 가지면서 과도하게 존재하는 퀜칭된 종을 포함하는 퀜칭 방출형 분석이 있습니다. 일단 형광 화합물이 효소 반응으로 인해 또는 상호 보완적인 DNA 결합으로 방출되면, 시스템의 수명이 바뀌게 됩니다. FLT는 에너지 전송 효율 측정을 위해 FREAT(Förster 공명 에너지 전송) 분석과 결합할 수 있습니다.

형광 수명 감지

이 기법은 프로브의 수명 또는 붕괴 시간 변화에 기반을 두고 있습니다. 나노초(ns)의 붕괴 시간은 위상 변조에 의해 측정할 수 있습니다. 이 기술은 pH, Ca2+, K+, 포도당 및 기타 대사물의 감지에 광범위하게 사용되었습니다. 최근 응용분야의 기술 개발에서는 근적외선 영역에서 자극 및 방출 스펙트럼을 가진 광학 프로브를 사용하여 조직과 기타 랜덤 배양 배지의 수명 기반 감지를 적용하고 있습니다.4,5

형광 수명 이미지(FLI)

이는 비교적 새로운 기술로 모든 이미지 픽셀에서 형광 붕괴 시간의 공간 분포를 동시에 결정하는 것을 포함합니다. 형광단의 형광 수명은 분자 환경에 따라 달라지지만 농도에 따라 달라지지 않는다는 사실에 기반을 두고 있습니다. 이는 국지적 프로브 농도를 제어할 수 없는 형광 현미 기술에 적용할 수 있습니다. 형광 수명 이미지 검경(FLIM)은 분자 환경 매개변수 측정, Förster 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 단백질 상호작용, 자기 형광을 통한 세포와 조직의 대사 상태를 측정하는 데 사용됩니다. 분자 환경 매개변수는 형광 퀜칭 또는 형광단의 구조 변화에 의해 유도된 수명 변화에서 측정할 수 있습니다. FLIM은 조직 표면의 주사, 조직 유형의 매핑, 광역학 요법, DNA 칩 분석, 스킨 이미징 등을 포함한 생물학적 응용분야에 사용할 수 있습니다.6

약한 방사체는 형광 수명이 짧은 반면, 수명이 긴 형광단은 낮은 광자 회전율을 가집니다. 제한된 민감도와 장시간 노출 및 획득 시간을 필요로 하기 때문에 수명 이미징에는 그다지 유용하지 않습니다.

수명 영상에서 일반적으로 사용되는 다양한 종류의 형광 분자와 프로브는 아래에 나열되어 있습니다.

1.
Berezin MY, Achilefu S. 2010. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.. 110(5):2641-2684. https://doi.org/10.1021/cr900343z
2.
Szmacinski H, Lakowicz JR. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing and imaging. Sensors and Actuators B: Chemical. 29(1-3):16-24. https://doi.org/10.1016/0925-4005(95)01658-9
3.
Doering K, Meder G, Hinnenberger M, Woelcke J, Mayr LM, Hassiepen U. 2009. A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Protease Inhibitor Profiling on Human Kallikrein 7. J Biomol Screen. 14(1):1-9. https://doi.org/10.1177/1087057108327328
4.
Lakowicz JR. 1994. Topics in Fluorescence Spectroscopy. https://doi.org/10.1007/b112911
5.
Hutchinson C, Lakowicz J, Sevick-Muraca E. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing in tissues: a computational study. Biophysical Journal. 68(4):1574-1582. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(95)80330-9
6.
Clegg RM, Holub O, Gohlke C. 2003. [22] Fluorescence lifetime-resolved imaging: Measuring lifetimes in an image.509-542. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(03)60126-6
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