리포솜 준비 - Avanti^® Polar Lipids

Stephen Burgess 박사

Avanti® Polar Lipids 최고 과학 책임자

1. 소포 형성 기전

리포솜(지질 소포)은 얇은 지질 필름 또는 지질 케이크가 수화되고 액정 이중층 스택이 유동하고 부풀 때 형성됩니다. 수화된 지질 시트는 교반 중에 분리되고 스스로 닫혀 가장자리에 있는 이중층의 탄화수소 핵과 물의 상호 작용을 막는 큰 다층 소포(LMV)를 형성합니다. 이 입자들이 형성되고 나면 입자 크기를 줄이기 위해서는 음향 에너지(초음파 처리) 또는 기계적 에너지(압출) 형식의 에너지 투입이 필요합니다.

Lasic, D.D., Recherche 20, 904, 1989의 이미지

2. 리프솜 준비 방법

지질 제형의 특성은 조성(양이온, 음이온, 중성 지질)에 따라 달라질 수 있지만 조성에 상관없이 모든 지질 소포에 동일한 준비 방법을 사용할 수 있습니다. 절차의 일반적 요소에는 수화를 위한 지질 준비, 교반을 사용한 수화, 소포의 균질 분포를 위한 크기 측정이 포함됩니다.

A. 수화를 위한 지질 준비

혼합 지질 조성으로 리포솜을 준비할 때는 먼저 지질을 유기용제에 용해하고 혼합해 지질이 균질하게 혼합되도록 해야 합니다. 일반적으로 이 프로세스는 클로로포름 또는 클로로포름:메탄올 혼합물을 사용하여 실시됩니다. 목표는 지질의 완전 혼합을 위한 깨끗한 지질 용액을 얻는 것입니다. 일반적으로 지질 용액은 10-20mg lipid/ml의 유기용제에서 준비되지만 지질 가용성과 혼합이 허용 가능한 수준인 경우 이보다 높은 농도를 사용할 수 있습니다. 지질이 유기 용제에 완전히 혼합되면 용제를 제거하여 지질 필름을 만듭니다. 소량의 지질 용제(1 mL 미만)인 경우, 흄 후드에서 건조 질소 또는 아르곤 스트림을 사용하여 용제를 증발시킬 수 있습니다. 이보다 많은 양인 경우에는 회전 증발로 유기 용제를 제거하여 둥근 바닥 플라스크 측면에 얇은 지질 필름이 생성되도록 해야 합니다. 지질 필름은 바이알 또는 플라스크를 밤새 진공 펌프에 두는 방법으로 완전히 건조시켜 잔류 유기 용제를 제거합니다. 클로로포름 사용이 문제가 될 수 있는 경우에는 3차 부탄올 또는 시클로헥산에 지질을 용해합니다. 지질 용액을 용기에 옮기고 용기를 드라이아이스 블록에 두거나 용기를 드라이아이스-아세톤 또는 알코올(에탄올 또는 메탄올) 수조에서 와류로 동결시킵니다. 수조 절차를 사용할 때는 용기가 갑작스러운 온도 변화를 균열 없이 견딜 수 있도록 주의해야 합니다. 완전히 동결시킨 후 동결된 지질 케이크를 진공 펌프에 두고 건조될 때까지 동결 건조합니다(양에 따라 1-3일). 지질 케이크의 두께는 동결 건조에 사용하는 용기의 직경보다 크면 안 됩니다. 건조 지질 필름 또는 케이크는 진공 펌프에서 제거하고, 용기를 꽉 닫아 테이프로 봉한 후 수화 준비가 될 때까지 동결 보관할 수 있습니다.

B. 지질 필름/케이크 수화

건조 지질 필름/케이크는 간단히 건조 지질의 용기에 수성 배지를 첨가하고 여기시키면 수화됩니다. 수화 배지의 온도는 건조 지질 첨가 전에 최고 Tc인 지질의 젤-액정 변환 온도(Tc 또는 Tm) 이상이어야 합니다. 수화 배지 첨가 후에는 수화 기간 동안 Tc 이상에서 지질 부유액을 유지해야 합니다. 고변환 지질의 경우에는 지질 부유액을 둥근 바닥 플라스크에 옮기고 플라스크를 진공 없는 회전 증발 시스템에 두면 간단히 할 수 있습니다. 지질 부유액의 Tc 이상 온도로 유지되는 온수 수조에서 둥근 바닥 플라스크를 회전시키면 적절한 여기를 통해 지질을 유동상에서 수화시킬 수 있습니다. 지질 종류와 구조마다 수화 시간이 약간 다를 수 있지만 강력한 흔들기, 혼합 또는 휘젓기를 사용한 1시간의 수화 시간이 적극 권장됩니다. 또한 다운사이징 전에 소포 부유액을 밤새 세워 두면(에이징) 크기 측정 프로세스가 더 쉬워지고 크기 분포의 동질성이 향상되는 것으로 여겨집니다. 고변환 지질의 경우 온도가 상승하면 지질 가수 분해가 증가하기 때문에 에이징이 권장되지 않습니다.

수화 배지는 일반적으로 지질 소포의 응용분야에 따라 결정됩니다. 적절한 수화 배지에는 증류수, 완충액, 식염수 및 당액 등의 비전해질 용액이 포함됩니다. 생체 내 응용분야에는 생리적 삼투질 농도(290 mOsm/kg)가 권장됩니다. 이러한 조건을 충족하는 일반적으로 허용되는 용액은 0.9 % 염분, 5 % 포도당, 10 % 자당입니다. 수화 도중 일부 지질은 해당 구조 특유의 복합체를 형성합니다. 고전하 지질은 이온 강도가 낮은 용액으로 수화할 경우 점성이 있는 젤을 형성하는 것이 관찰되었습니다. 썸네일 이 문제는 염을 첨가하거나 지질 부유액을 다운사이징하여 완화할 수 있습니다. 포스파티딜에탄올아민처럼 수화가 잘 되지 않는 지질은 수화 시 자기 응집되는 경향이 있습니다. 60 mol %를 넘는 포스파티딜에탄올아민이 함유된 지질 소포는 소포를 둘러싼 작은 수화층이 있는 입자를 형성합니다. 입자들이 서로 접근하기 때문에 입자가 접근하지 못하도록 할 수화 반발력이 없고, 2개의 멤브레인이 에너지 우물에 빠져 고착되고 응집을 형성합니다. 응집은 용액에서 큰 응집물로 침전되고 여기 시 확산되지만 침전 시 재형성됩니다. 수화 생성물은 구조상 양파와 비슷한 큰 다층 소포(LMV)이며, 각 지질 이중층은 수층으로 분리됩니다. 지질 층 사이의 간격은 정전기적 반발력을 기반으로 분리되는 고전하층보다 여러 수화층이 더 가까운 조성에 의해 결정됩니다. 안정적이고 수화된 LMV 부유액이 생성되면 초음파 처리 또는 압출을 비롯한 다양한 기법으로 입자를 다운사이징할 수 있습니다.

C. 지질 부유액 크기 조정

i. 초음파 처리

음파 에너지(초음파 처리)를 사용한 LMV 부유액 교란은 일반적으로 직경이 15-50 nm인 작은 단일 박막 소포(SUV)를 생성합니다. 초음파 처리된 입자의 준비에 가장 일반적인 기기는 수조 및 프로브 팁 초음파 발생 장치입니다. 이만큼 널리 사용되지는 않지만 컵-혼 초음파 발생 장치도 성공적으로 SUV를 생성했습니다. 프로브 팁 초음파 발생 장치는 지질 부유액에 고에너지를 투입하지만 지질 부유액의 과열로 인한 분해가 발생합니다. 초음파 처리 팁은 또 사용 전에 원심분리로 제거해야 하는 티타늄 입자를 지질 부유액에 방출하는 경향이 있습니다. 이런 이유로 수조 초음파 발생 장치가 SUV 준비에 가장 널리 사용되는 기기입니다. LMV 확산의 초음파 처리는 부유액이 든 테스트 튜브를 수조 초음파 발생 장치에 두고(또는 초음파 발생 장치의 팁을 테스트 튜브에 두고) 지질의 Tc 이상으로 5-10분 초음파 처리하여 달성합니다. 지질 부유액이 맑아지기 시작해 약간 뿌연 투명 용액이 생성되어야 합니다. 뿌연 것은 부유액에 남아 있는 큰 잔류 입자로 인한 빛 산란 때문입니다. 이 입자들을 원심분리로 제거하여 투명한 SUV 부유액을 생성할 수 있습니다. 평균 크기와 분포는 조성과 농도, 온도, 초음파 처리 시간 및 동력, 용적, 초음파 처리 장치 조정의 영향을 받습니다. 초음파 처리 조건을 재현하는 것이 거의 불가능하기 때문에 서로 다른 시간에 생성된 배치의 크기가 다른 것은 드문 일이 아닙니다. 또한 이 멤브레인의 곡률이 높기 때문에 SUV는 본질적으로 불안정하며, 상전이 온도 미만으로 보관하는 경우 자연스럽게 결합되어 더 큰 소포를 형성합니다.

ii. 압출

지질 압출은 지질 부유액을 구멍 크기가 규정된 폴리카보네이트 필터에 통과시켜 사용된 필터 구멍 크기에 가까운 직경을 갖는 입자를 만들어내는 기법입니다. 최종 구멍 크기를 통한 압출에 앞서 몇 차례의 동결-해동 주기 또는 더 큰 구멍 크기(일반적으로 0.2 µm-1.0 µm)를 통해 LMV 부유액을 사전 필터링하여 LMV를 교란합니다. 이 방법은 멤브레인의 파울링을 방지하는 데 도움이 되며, 최종 부유액의 크기 분포 동질성을 향상시킵니다. LMV 확산 다운사이징을 위한 모든 절차와 마찬가지로 압출은 지질의 Tc 이상에서 실시해야 합니다. 구멍을 통과할 수 없는 단단한 멤브레인의 경우 파울링 경향이 있기 때문에 Tc 미만에서의 압출 시도는 성공하지 못합니다. 100 nm 구멍의 필터를 통한 압출은 일반적으로 평균 직경이 120-140 nm인 큰 단일 박막 소포(LUV)를 생성합니다. 평균 입자 크기는 지질 구성에 따라서도 달라지며, 배치가 달라져도 재현이 가능합니다.