Preparazione di librerie NGS

Kit per l’estrazione di DNA genomico

Per la preparazione di una libreria di DNA, il DNA genomico ad alto peso molecolare (gDNA) deve essere estratto da cellule, tessuti o altri tipi di campioni. Per potere fornire prestazioni ottimali nelle successive reazioni di amplificazione o sequenziamento il DNA genomico purificato dovrebbe avere bassi livelli di frammentazione e di contaminanti biologici e chimici

Il kit di estrazione del DNA ad alto peso molecolare Fire Monkey™/Fire Flower™ consente l'isolamento di DNA genomico con elevata purezza, minima frammentazione e bassi livelli di contaminazione di acidi nucleici a basso peso molecolare.

• Il Fire Monkey™ consiste in un classico processo di centrifugazione su colonna che consente di estrarre il DNA ad alto peso molecolare, con filamenti di lunghezza media >100kb, da cellule batteriche o di mammifero in 1 ora.
• Il Fire Flower™ consiste in un processo standard di centrifugazione su colonna in grado di selezionare il DNA estratto da qualsiasi tipo di campione in base alle dimensioni, in 15 minuti. Il Fire Flower™ può aumentare la lunghezza media complessiva dei filamenti di DNA del 30%, rimuovendo i frammenti inferiori a 30 kb.

Kit di amplificazione dell'intero genoma

L'analisi della sequenza del DNA è spesso limitata dalla piccola quantità di campione disponibile o da una bassa resa di estrazione. Quando il materiale di partenza è limitato, per aumentare la quantità di DNA iniziale si possono utilizzare delle tecniche di amplificazione. L'amplificazione dell'intero genoma (WGA) viene usata per pre-amplificare i campioni di DNA, sia intatti che molto frammentati, che saranno utilizzati nelle procedure di NGS.

Il kit SeqPlex-I WGA consente l'amplificazione di piccole quantità di DNA, DNA degradato, o DNA altamente frammentato da usare come input in celle a flusso per il sequenziamento di nuova generazione Illumina®.

• Facilita il sequenziamento a partire da soli 100 pg di DNA
• Enhanced primer disegnati per una copertura completa del genoma, distorsione minima della sequenza e dimensioni dell'amplicone ideali per il sequenziamento di nuova generazione (NGS)
• Economicamente vantaggioso: nessun passaggio aggiuntivo per la preparazione della libreria NGS
• Compatibile con il sequenziamento di nuova generazione Illumina^®

Il kit per l'amplificazione dell'intero genoma SeqPlex Enhanced DNA Amplification è stato progettato per facilitare il sequenziamento di nuova generazione da quantità di DNA estremamente piccole o da DNA degradato/altamente frammentato. Questo kit è stato sviluppato a vantaggio dell'integrazione nelle procedure di sequenziamento Illumina^®, SOLID™ o 454.

• La tecnologia random priming amplifica il DNA frammentato, come quello ottenuto da ChIP o campioni FFPE
• Facilita il sequenziamento a partire da un soli 100 pg di DNA da ChIP
• Enhanced primer disegnati per una copertura completa del genoma, bias di sequenza minimi e rimozione dei primer
• Compatibile con le librerie per il sequenziamento di nuova generazione Illumina^®, SOLiD™, o 454

Kit di amplificazione dell’intero trascrittoma

L'obiettivo principale nella preparazione di una libreria NGS per RNA-Seq è quello di massimizzare la complessità della libreria del trascrittoma per rappresentare completamente il pool di sequenze iniziale, riducendo al contempo i bias. L'RNA-Seq per la profilazione high-throughput dell'espressione genica e per l'analisi del trascrittoma risulta difficile nel caso si disponga di una limitata quantità di RNA iniziale. La WTA (amplificazione dell'intero trascrittoma) può essere utilizzata per generare quantità sufficienti di target di sequenziamento a partire da piccole quantità di RNA, essa richiede però una replicazione del trascritto ad alta fedeltà e senza perdite di specifici mRNA, per ridurre il bias della libreria.

Il kit SeqPlex-I WTA consente l'amplificazione di piccole quantità di RNA ottenuto mediante trascrizione inversa o di RNA degradato come input per celle a flusso nel sequenziamento di nuova generazione (NGS) Illumina®.

• Amplifica l’RNA totale frammentato o presente in quantità molto limitate. L'RNA frammentato o intatto proveniente da diverse le fonti, inclusi campioni FFPE e RIP, può essere amplificato senza difficoltà utilizzando la tecnologia random priming
• Il design semi-degenerato dei primer garantisce una copertura del trascrittoma più completa e un priming efficiente.
• Meno passaggi: non è necessario frammentare il cDNA prima del sequenziamento
• Elevata efficienza: amplifica il ds-cDNA in 8 ore o meno
• Economicamente vantaggioso: non richiede più un passaggio aggiuntivo di preparazione della libreria NGS
• Compatibile con il sequenziamento di nuova generazione Illumina^®

Il kit SeqPlex RNA Amplification per l'amplificazione dell'intero trascrittoma (WTA), è progettato per facilitare il sequenziamento di nuova generazione (NGS) a partire da piccole quantità di RNA o da RNA degradato/altamente frammentato (ad es. RNA da campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE)). Il kit SeqPlex consente all'utente di pre-amplificare i campioni di RNA da usare come input in un flusso di lavoro NGS.

• La tecnologia random priming amplifica piccole quantità di RNA frammentato o intatto a partire da qualsiasi tipo di campione, inclusi FFPE e RIP
• Design di primer semi-degenerati per una copertura del trascrittoma più completa e un priming efficiente
• Non è necessario frammentare il DNA prima del sequenziamento
• Amplifica il ds-cDNA in 8 ore o meno
• Compatibile con tutte le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione ad eccezione di Pacific Bioscience

Preparazione di librerie di small RNA

Le tecnologie NGS hanno rivoluzionato lo studio degli small RNA, tra cui miRNA, siRNA e piRNA, che svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. Il sequenziamento rappresenta un approccio sempre più usato nella scoperta e profilazione degli small RNA. Tuttavia, i metodi di preparazione delle librerie di small RNA possono introdurre bias significativi, in particolare durante le fasi di ligazione dell'adattatore.

Il kit di preparazione di librerie di RNA RealSeq^®-AC offre un nuovo metodo per la preparazione di librerie per il sequenziamento di miRNA e small RNA che riduce il bias di incorporazione nel NGS. Utilizzando un nuovo adattatore singolo e la circolarizzazione, RealSeq^® riduce notevolmente l’introduzione di bias nella fase di preparazione della libreria. Questa tecnologia risolve il problema delle preparazioni di librerie di sequenziamento comunemente utilizzate che comportano un deficit nella rilevazione di molti miRNA.

• Riduce significativamente il bias di sequenziamento nel sequenziamento degli small RNA
• Quantifica accuratamente gli small RNA biologicamente rilevanti
• Consente una più efficiente identificazione di nuovi small RNA

Purificazione della libreria

La purificazione della libreria NGS consiste nella rimozione di adattatori per il sequenziamento, primer per PCR, dNTP, enzimi e altri contaminanti e consente la selezione di acidi nucleici che rientrano nell'intervallo di dimensioni corretto per il sequenziamento a valle. I metodi di purificazione della libreria devono massimizzare la resa e il recupero, ridurre al minimo la presenza di contaminanti biologici e chimici e rimuovere i frammenti di acidi nucleici o le molecole indesiderate in preparazione del sequenziamento.

Il sistema di purificazione HighPrep™ PCR consiste in un un reagente per la purificazione post-PCR basato su biglie paramagnetiche, progettato per una efficiente purificazione dei frammenti di DNA e la selezione di ampliconi di dimensioni specifiche. La purificazione consente la rimozione di sali, primer, primer-dimeri e dNTP, in quanto solo i frammenti di DNA restano legati alle biglie magnetiche. Le biglie magnetiche sono utilizzate in diverse chimiche di preparazione delle librerie per NGS.

• Recupero elevato di ampliconi >100 bp
• Adattabile a sistemi di gestione dei liquidi ad alta produttività
• Recupero consistente degli ampliconi > 100 bp, selezione delle dimensioni prevedibile e uniforme
• Centrifugazione e filtrazione non portano a rese più elevate e più pure

Risorse sui prodotti