S7111
Kit ApopTag Plus per il rilevamento dell′apoptosi in situ con fluoresceina
The ApopTag Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit detects apoptotic cells in situ by the indirect TUNEL method, utilizing an anti-digoxigenin antibody that is conjugated to a fluorescein reporter molecule.
Sinonimo/i:
Apoptosis detection kit
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About This Item
Codice UNSPSC:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.84
Prodotti consigliati
Livello qualitativo
Produttore/marchio commerciale
ApopTag
Chemicon®
tecniche
flow cytometry: suitable
immunocytochemistry: suitable
immunohistochemistry (formalin-fixed, paraffin-embedded sections): suitable
Metodo di rivelazione
fluorometric
Condizioni di spedizione
dry ice
Descrizione generale
Il kit ApopTag per il rilevamento dell′apoptosi in situ con fluoresceina rileva cellule apoptotiche in situ tramite il metodo indiretto TUNEL, utilizzando un anticorpo anti-digossigenina coniugato alla molecola reporter fluoresceina. Il kit fornisce reagenti sufficienti per la rilevazione immunofluorescente di 40 campioni e include i vetrini di controllo positivo ApopTag. I risultati vengono analizzati mediante citometria a flusso o microscopia a fluorescenza.
ll kit di rilevamento dell'apoptosi in situ ApopTag Fluoresceina è stato testato per la colorazione specifica nei seguenti sistemi modello: (a) linfociti periferici normali umani indotti con desametasone con colorazione su citospin, (b) ghiandola mammaria di ratto in regressione, colorazione su sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina (c) linfociti periferici leucemici umani indotti con camptotecina, colorazione di sospensioni cellulari e analisi in citometria a flusso quantitativa.
ll kit di rilevamento dell'apoptosi in situ ApopTag Fluoresceina è stato testato per la colorazione specifica nei seguenti sistemi modello: (a) linfociti periferici normali umani indotti con desametasone con colorazione su citospin, (b) ghiandola mammaria di ratto in regressione, colorazione su sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina (c) linfociti periferici leucemici umani indotti con camptotecina, colorazione di sospensioni cellulari e analisi in citometria a flusso quantitativa.
Applicazioni
INTRODUZIONE
I kit ApopTag per il rilevamento dell′apoptosi in situ marcano le cellule apoptotiche presenti nei campioni modificandone il DNA genomico mediante l′enzima deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) e consentono il rilevamento delle cellule apoptotiche mediante una colorazione specifica. Questo manuale contiene le informazioni e i protocolli relativi al kit ApopTag per il rilevamento dell‘apoptosi in situ (N. Cat. S7111).
Principi del metodo
I reagenti forniti in tutti i kit ApopTag prevedono la marcatura in situ delle estremità 3′OH libere del DNA con nucleotidi marcati e non marcati. I nucleotidi contenuti nel tampone di reazione vengono aggiunti enzimaticamente al DNA dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (13, 31). La TdT catalizza l′aggiunta indipendente dal templato di nucleotidi trifosfati alle estremità 3′-OH del DNA a doppio o a singolo filamento. I nucleotidi incorporati formano un oligomero composto da nucleotidi coniugati con digossigenina e nucleotidi non marcati disposti in sequenza casuale. Nei kit ApopTag, il rapporto tra i nucleotidi marcati e quelli non marcati è ottimizzato per promuovere il legame dell'anticorpo anti-digossigenina o per minimizzare il self-quenching della fluoresceina. L′esatta lunghezza dell'oligomero aggiunto non è stata misurata.
I frammenti di DNA marcati con il nucleotide-digossigenina legano quindi un anticorpo anti-digossigenina coniugato alla fluoresceina (Figura 1A). Gli anticorpi fluorescenti forniscono un rilevamento sensibile sia in immunoistochimica che in immunocitochimica (cioè su tessuti o su cellule) e non sono soggetti alle variazioni sperimentali legate all′uso di un substrato o alla fase di sviluppo. Questo sistema misto molecolare-istochimico consente di colorare in modo sensibile e specifico le estremità 3′-OH che sono presenti ad elevate concentrazioni nei corpi apoptotici.
Il sistema ApopTag differisce significativamente dalle tecniche di marcatura per lo studio dell'apoptosi in situ precedentemente descritte (13, 16, 38, 46), nelle quali il legame dell'avidina alla biotina cellulare endogena poteva essere fonte di errore. Il sistema digossigenina/anti-digossigenina possiede una sensibilità paragonabile quella dei sistemi avidina/biotina (22). Nei tessuti animali, i ligandi che potrebbero dare un legame aspecifico con l′anticorpo anti-digossigenina sono generalmente presenti in quantità insignificanti, il che assicura una bassa colorazione di fondo. Il reagente anti-digossigenina specifico utilizzato nei kit ApopTag è un anticorpo policlonale di pecora purificato per affinità che mostra una reattività crociata pari a <1% con i principali steroidi dei vertebrati. Inoltre, la porzione Fc di questo anticorpo viene rimossa mediante digestione proteolitica per eliminare qualsiasi adsorbimento non specifico con i recettori Fc cellulari.
I kit ApopTag per il rilevamento dell′apoptosi in situ marcano le cellule apoptotiche presenti nei campioni modificandone il DNA genomico mediante l′enzima deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) e consentono il rilevamento delle cellule apoptotiche mediante una colorazione specifica. Questo manuale contiene le informazioni e i protocolli relativi al kit ApopTag per il rilevamento dell‘apoptosi in situ (N. Cat. S7111).
Principi del metodo
I reagenti forniti in tutti i kit ApopTag prevedono la marcatura in situ delle estremità 3′OH libere del DNA con nucleotidi marcati e non marcati. I nucleotidi contenuti nel tampone di reazione vengono aggiunti enzimaticamente al DNA dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (13, 31). La TdT catalizza l′aggiunta indipendente dal templato di nucleotidi trifosfati alle estremità 3′-OH del DNA a doppio o a singolo filamento. I nucleotidi incorporati formano un oligomero composto da nucleotidi coniugati con digossigenina e nucleotidi non marcati disposti in sequenza casuale. Nei kit ApopTag, il rapporto tra i nucleotidi marcati e quelli non marcati è ottimizzato per promuovere il legame dell'anticorpo anti-digossigenina o per minimizzare il self-quenching della fluoresceina. L′esatta lunghezza dell'oligomero aggiunto non è stata misurata.
I frammenti di DNA marcati con il nucleotide-digossigenina legano quindi un anticorpo anti-digossigenina coniugato alla fluoresceina (Figura 1A). Gli anticorpi fluorescenti forniscono un rilevamento sensibile sia in immunoistochimica che in immunocitochimica (cioè su tessuti o su cellule) e non sono soggetti alle variazioni sperimentali legate all′uso di un substrato o alla fase di sviluppo. Questo sistema misto molecolare-istochimico consente di colorare in modo sensibile e specifico le estremità 3′-OH che sono presenti ad elevate concentrazioni nei corpi apoptotici.
Il sistema ApopTag differisce significativamente dalle tecniche di marcatura per lo studio dell'apoptosi in situ precedentemente descritte (13, 16, 38, 46), nelle quali il legame dell'avidina alla biotina cellulare endogena poteva essere fonte di errore. Il sistema digossigenina/anti-digossigenina possiede una sensibilità paragonabile quella dei sistemi avidina/biotina (22). Nei tessuti animali, i ligandi che potrebbero dare un legame aspecifico con l′anticorpo anti-digossigenina sono generalmente presenti in quantità insignificanti, il che assicura una bassa colorazione di fondo. Il reagente anti-digossigenina specifico utilizzato nei kit ApopTag è un anticorpo policlonale di pecora purificato per affinità che mostra una reattività crociata pari a <1% con i principali steroidi dei vertebrati. Inoltre, la porzione Fc di questo anticorpo viene rimossa mediante digestione proteolitica per eliminare qualsiasi adsorbimento non specifico con i recettori Fc cellulari.
Il kit ApopTag per il rilevamento dell′apoptosi in situ con fluoresceina rileva cellule apoptotiche in situ tramite il metodo indiretto TUNEL, utilizzando un anticorpo anti-digossigenina coniugato alla molecola reporter fluoresceina.
Componenti
Tampone di equilibrazione 90416 3,0 ml da -15°C a -25°C
Tampone di reazione 90417 2,0 ml da -15°C a -25°C
EnzimaTdT 90418 0,64 ml da -15°C a -25°C
Tampone di arresto/lavaggio 90419 20 ml da -15°C a -25°C
Soluzione di bloccaggio 90425 2.6 ml da -15°C a -25°C
Anti-digossigenina-fluoresceina* 90426 2,1 ml da 2°C a 8°C
Vetrini coprioggetto in plastica 90421 100 per conf. Temperatura ambiente
Vetrini di controllo 90422 2 ciascuno. Temperatura ambiente
*anticorpo policlonale di pecora purificato per affinità
Tampone di reazione 90417 2,0 ml da -15°C a -25°C
EnzimaTdT 90418 0,64 ml da -15°C a -25°C
Tampone di arresto/lavaggio 90419 20 ml da -15°C a -25°C
Soluzione di bloccaggio 90425 2.6 ml da -15°C a -25°C
Anti-digossigenina-fluoresceina* 90426 2,1 ml da 2°C a 8°C
Vetrini coprioggetto in plastica 90421 100 per conf. Temperatura ambiente
Vetrini di controllo 90422 2 ciascuno. Temperatura ambiente
*anticorpo policlonale di pecora purificato per affinità
Stoccaggio e stabilità
1. Conservare il kit tra -15°C e -25°C fino al primo utilizzo. Dopo il primo utilizzo, il kit ha durata di tre mesi conservando l′enzima TdT (#90418) tra -15°C e -25°C e gli altri componenti tra 2°C e 8°C.
2. Evitare di esporre l'anticorpo anti-digossigenina-fluoresceina (#90426) alla luce quando non necessario.
Precauzioni
1. I seguenti componenti del kit contengono cacodilato di potassio (acido dimetilarsinico) come tampone: tampone di equilibrazione (#90416), tampone di reazione (#90417) ed enzima TdT (#90418). Questi componenti sono nocivi se ingeriti; evitare il contatto con la cute e gli occhi (indossare guanti e occhiali) e lavare immediatamente le aree di contatto.
2. Gli anticorpi coniugati (#90426) e le soluzioni di bloccaggio (#. 90425) contengono lo 0,08% di azoturo di sodio come conservante.
3. L′enzima TdT (#90418) contiene glicerolo e non congela a -20°C. Per conservare più a lungo, non lasciare scaldare il reagente a temperatura ambiente prima di prelevarlo.
2. Evitare di esporre l'anticorpo anti-digossigenina-fluoresceina (#90426) alla luce quando non necessario.
Precauzioni
1. I seguenti componenti del kit contengono cacodilato di potassio (acido dimetilarsinico) come tampone: tampone di equilibrazione (#90416), tampone di reazione (#90417) ed enzima TdT (#90418). Questi componenti sono nocivi se ingeriti; evitare il contatto con la cute e gli occhi (indossare guanti e occhiali) e lavare immediatamente le aree di contatto.
2. Gli anticorpi coniugati (#90426) e le soluzioni di bloccaggio (#. 90425) contengono lo 0,08% di azoturo di sodio come conservante.
3. L′enzima TdT (#90418) contiene glicerolo e non congela a -20°C. Per conservare più a lungo, non lasciare scaldare il reagente a temperatura ambiente prima di prelevarlo.
Note legali
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Esclusione di responsabilità
Salvo diversa indicazione nel nostro catalogo o in altra documentazione fornita dall′azienda insieme al prodotto, i nostri prodotti sono destinati esclusivamente a scopi di ricerca e non devono essere utilizzati per altre finalità, inclusi a titolo esemplificativo ma non esaustivo, fini commerciali non autorizzati, applicazioni diagnostiche in vitro, usi terapeutici ex vivo o in vivo o qualsiasi altro tipo di assunzione o applicazione rivolta agli esseri umani o agli animali.
Avvertenze
Danger
Indicazioni di pericolo
Consigli di prudenza
Classi di pericolo
Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - STOT RE 2 Inhalation
Organi bersaglio
Respiratory Tract
Codice della classe di stoccaggio
6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects
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