S7110
Kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag
The ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit detects apoptotic cells in situ by the indirect TUNEL method, utilizing an anti-digoxigenin antibody that is conjugated to a Fluorescein reporter molecule.
Synonyme(s) :
Apoptosis detection kit
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About This Item
Code UNSPSC :
12161503
eCl@ss :
32161000
Nomenclature NACRES :
NA.84
Produits recommandés
Niveau de qualité
Fabricant/nom de marque
ApopTag
Chemicon®
Technique(s)
flow cytometry: suitable
immunocytochemistry: suitable
immunohistochemistry (formalin-fixed, paraffin-embedded sections): suitable
Méthode de détection
fluorometric
Conditions d'expédition
dry ice
Description générale
Le kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag détecte les cellules apoptotiques in situ par la méthode TUNEL indirecte, à l'aide d'un anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine servant de molécule rapporteur. Il peut assurer le marquage indirect par immunofluorescence de 40 échantillons. Les résultats peuvent être analysés par cytométrie en flux ou par microscopie en fluorescence.
Le kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag a fait l'objet de tests de marquage spécifique sur les systèmes modèles suivants : (a) lymphocytes de sang périphérique normal humain induits par la dexaméthasone et marqués avec une méthode Cytospin, (b) glande mammaire de rat en régression, avec marquage sur coupes fixées au formol et incluses en paraffine, et (c) lymphocytes de sang périphérique leucémique humain induits par la camptothécine, avec marquage sur suspensions cellulaires et utilisés pour de la cytométrie en flux quantitative.
Le kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag a fait l'objet de tests de marquage spécifique sur les systèmes modèles suivants : (a) lymphocytes de sang périphérique normal humain induits par la dexaméthasone et marqués avec une méthode Cytospin, (b) glande mammaire de rat en régression, avec marquage sur coupes fixées au formol et incluses en paraffine, et (c) lymphocytes de sang périphérique leucémique humain induits par la camptothécine, avec marquage sur suspensions cellulaires et utilisés pour de la cytométrie en flux quantitative.
Application
INTRODUCTION
Les kits de détection in situ de mort cellulaire ApopTag permettent de marquer les cellules apoptotiques au sein des échantillons utilisés en recherche, en modifiant l'ADN génomique à l'aide de désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT) pour détecter les cellules positives par coloration spécifique. Ce manuel contient des informations et des protocoles destinés au kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag (référence S7110).
Principes de la procédure
Les réactifs fournis dans les kits ApopTag sont conçus pour marquer in situ les extrémités 3′OH libres de l'ADN à l'aide de nucléotides non marqués et de nucléotides chimiquement marqués. Les nucléotides contenus dans le tampon de réaction sont ajoutés à l'ADN par voie enzymatique grâce à la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT) (13, 31). La TdT catalyse l'addition de nucléotides triphosphates sur les extrémités 3′-OH de l'ADN double brin et simple brin, sans intervention de matrice. Les nucléotides incorporés forment un oligomère composé d'un nucléotide marqué à la digoxigénine et d'un nucléotide non marqué selon une séquence aléatoire. Le rapport entre le nucléotide marqué et le nucléotide non marqué dans les kits ApopTag est optimisé de façon à promouvoir la liaison de l'anticorps anti-digoxigénine, ou à réduire au minimum l'auto-extinction ("self-quenching") de la fluorescéine. La longueur exacte de l'oligomère ajouté n'a pas été mesurée.
Les fragments d'ADN marqués avec le nucléotide-digoxigénine sont ensuite mis en présence d'un anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine (Figure 1A). Les anticorps fluorescents assurent une détection sensible en immunohistochimie ou en immunocytochimie (c'est-à-dire sur un tissu ou des cellules) et ne sont sujets à aucune variabilité expérimentale due au substrat ou à la phase de développement. Ces systèmes biologiques-histochimiques moléculaires mixtes permettent d'obtenir un marquage spécifique et sensible de très fortes concentrations d'extrémités 3′-OH localisées dans les corps apoptotiques. Le système ApopTag est très différent des techniques de marquage in situ de l'apoptose décrites précédemment (13, 16, 38, 46), dans lesquelles la liaison de l'avidine à la biotine cellulaire peut constituer une source d'erreur. Les études montrent que le système digoxigénine/anticorps anti-digoxigénine est aussi sensible que les systèmes avidine/biotine (22). Les ligands similaires sur le plan immunochimique et pouvant se lier à l'anticorps anti-digoxigénine sont généralement présents en quantité négligeable dans les tissus animaux, ce qui garantit une faible coloration de fond. L'anticorps polyclonal de mouton purifié par affinité est le réactif anti-digoxigénine spécifiquement utilisé dans les kits ApopTag ; il présente une réactivité croisée <1 % avec les principaux stéroïdes des vertébrés. En outre, la partie Fc de cet anticorps a été retirée par digestion protéolytique afin de supprimer toute adsorption non spécifique sur les récepteurs Fc cellulaires.
Les kits de détection in situ de mort cellulaire ApopTag permettent de marquer les cellules apoptotiques au sein des échantillons utilisés en recherche, en modifiant l'ADN génomique à l'aide de désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT) pour détecter les cellules positives par coloration spécifique. Ce manuel contient des informations et des protocoles destinés au kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag (référence S7110).
Principes de la procédure
Les réactifs fournis dans les kits ApopTag sont conçus pour marquer in situ les extrémités 3′OH libres de l'ADN à l'aide de nucléotides non marqués et de nucléotides chimiquement marqués. Les nucléotides contenus dans le tampon de réaction sont ajoutés à l'ADN par voie enzymatique grâce à la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT) (13, 31). La TdT catalyse l'addition de nucléotides triphosphates sur les extrémités 3′-OH de l'ADN double brin et simple brin, sans intervention de matrice. Les nucléotides incorporés forment un oligomère composé d'un nucléotide marqué à la digoxigénine et d'un nucléotide non marqué selon une séquence aléatoire. Le rapport entre le nucléotide marqué et le nucléotide non marqué dans les kits ApopTag est optimisé de façon à promouvoir la liaison de l'anticorps anti-digoxigénine, ou à réduire au minimum l'auto-extinction ("self-quenching") de la fluorescéine. La longueur exacte de l'oligomère ajouté n'a pas été mesurée.
Les fragments d'ADN marqués avec le nucléotide-digoxigénine sont ensuite mis en présence d'un anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine (Figure 1A). Les anticorps fluorescents assurent une détection sensible en immunohistochimie ou en immunocytochimie (c'est-à-dire sur un tissu ou des cellules) et ne sont sujets à aucune variabilité expérimentale due au substrat ou à la phase de développement. Ces systèmes biologiques-histochimiques moléculaires mixtes permettent d'obtenir un marquage spécifique et sensible de très fortes concentrations d'extrémités 3′-OH localisées dans les corps apoptotiques. Le système ApopTag est très différent des techniques de marquage in situ de l'apoptose décrites précédemment (13, 16, 38, 46), dans lesquelles la liaison de l'avidine à la biotine cellulaire peut constituer une source d'erreur. Les études montrent que le système digoxigénine/anticorps anti-digoxigénine est aussi sensible que les systèmes avidine/biotine (22). Les ligands similaires sur le plan immunochimique et pouvant se lier à l'anticorps anti-digoxigénine sont généralement présents en quantité négligeable dans les tissus animaux, ce qui garantit une faible coloration de fond. L'anticorps polyclonal de mouton purifié par affinité est le réactif anti-digoxigénine spécifiquement utilisé dans les kits ApopTag ; il présente une réactivité croisée <1 % avec les principaux stéroïdes des vertébrés. En outre, la partie Fc de cet anticorps a été retirée par digestion protéolytique afin de supprimer toute adsorption non spécifique sur les récepteurs Fc cellulaires.
Le kit de détection in situ de mort cellulaire avec fluorescéine ApopTag détecte les cellules apoptotiques in situ par la méthode TUNEL indirecte, à l'aide d'un anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine servant de molécule rapporteur.
Composants
Tampon d'équilibration, réf. 90416, 3,0 ml, -15 °C à -25 °C
Tampon de réaction, réf. 90417, 2,0 ml, -15 °C à -25 °C
Enzyme TdT, réf. 90418, 0,64 ml, -15 °C à -25 °C
Tampon de lavage/arrêt, réf. 90419, 20 ml, -15 °C à -25 °C
Tampon de blocage, réf. 90425, 2,6 ml, -15 °C à -25 °C
Anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine*, réf. 90426, 2,1 ml, 2 °C à 8 °C
Lamelles en plastique, réf. 90421, 100 unités, température ambiante
* Anticorps polyclonal de mouton purifié par affinité
Tampon de réaction, réf. 90417, 2,0 ml, -15 °C à -25 °C
Enzyme TdT, réf. 90418, 0,64 ml, -15 °C à -25 °C
Tampon de lavage/arrêt, réf. 90419, 20 ml, -15 °C à -25 °C
Tampon de blocage, réf. 90425, 2,6 ml, -15 °C à -25 °C
Anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine*, réf. 90426, 2,1 ml, 2 °C à 8 °C
Lamelles en plastique, réf. 90421, 100 unités, température ambiante
* Anticorps polyclonal de mouton purifié par affinité
Stockage et stabilité
1. Conserver le kit entre -15 °C et -25 °C jusqu'à ouverture. Une fois le kit ouvert, s'il est censé être utilisé dans les trois mois, conserver l'enzyme TdT (réf. 90418) entre -15 °C et -25 °C et les autres éléments entre 2 °C et 8 °C.
2. Protéger l'anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine (réf. 90426) de toute exposition inutile à la lumière.
Précautions
1. Les éléments suivants du kit contiennent du cacodylate de potassium (acide diméthylarsinique) en tant que tampon : tampon d'équilibration (réf. 90416), tampon de réaction (réf. 90417) et enzyme TdT (réf. 90418). Ces éléments sont nocifs en cas d'ingestion ; éviter tout contact avec la peau et les yeux (porter des gants et des lunettes de protection) et rincer immédiatement en cas de contact.
2. Les anticorps conjugués (réf. 90426) et les solutions de blocage (réf. 90425) contiennent 0,08 % d'azoture de sodium en tant qu'agent conservateur.
3. L'enzyme TdT (réf. 90418) contient du glycérol ; elle ne gèle pas à -20 °C. Pour une durée de conservation maximale, ne pas amener ce réactif à température ambiante avant utilisation.
2. Protéger l'anticorps anti-digoxigénine conjugué à de la fluorescéine (réf. 90426) de toute exposition inutile à la lumière.
Précautions
1. Les éléments suivants du kit contiennent du cacodylate de potassium (acide diméthylarsinique) en tant que tampon : tampon d'équilibration (réf. 90416), tampon de réaction (réf. 90417) et enzyme TdT (réf. 90418). Ces éléments sont nocifs en cas d'ingestion ; éviter tout contact avec la peau et les yeux (porter des gants et des lunettes de protection) et rincer immédiatement en cas de contact.
2. Les anticorps conjugués (réf. 90426) et les solutions de blocage (réf. 90425) contiennent 0,08 % d'azoture de sodium en tant qu'agent conservateur.
3. L'enzyme TdT (réf. 90418) contient du glycérol ; elle ne gèle pas à -20 °C. Pour une durée de conservation maximale, ne pas amener ce réactif à température ambiante avant utilisation.
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Clause de non-responsabilité
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Mention d'avertissement
Danger
Mentions de danger
Conseils de prudence
Classification des risques
Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - STOT RE 2 Inhalation
Organes cibles
Respiratory Tract
Code de la classe de stockage
6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects
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