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DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut

kit of for 25 reactions

• Synonym(e): DNA-Isolierung
• UNSPSC-Code: 41105500

Eigenschaften

• Qualitätsniveau: 100
• Hersteller/Markenname: Roche
• Verpackung: kit of for 25 reactions

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Das DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut ermöglicht eine schnelle Isolierung der DNA aus 1 bis 10 ml Säugetiervollblut, Lymphozyten oder Buffy-Coat-Proben.

Die Isolierung von DNA aus Vollblut kann schwierig sein, da Blut eine komplexe Zusammensetzung aus Zellen, Proteinen, Mataboliten etc. ist. Die meisten Zellen (>99 %) sind Erythrozyten (rote Blutkörperchen), die keinen Zellkern und folglich auch keine DNA enthalten. Leukozyten (weiße Blutkörperchen) enthalten Zellkerne und DNA. Deshalb muss die im Blut enthaltene DNA aus einer der drei Leukozytenarten isoliert werden: Monozyten, Lymphozyten oder Granulozyten.

Probenmaterial:
Humanes Vollblut (das mit Natriumheparin, EDTA oder Natriumcitrat behandelt wurde): 1 bis 10 ml
Isolierte Lymphozyten: 1 bis 10 ml
Isolierter Buffy-Coat: Buffy-Coat aus 10 bis 20 ml Vollblut, der mindestens 1,0 x 107 Leukozyten enthält.

Reinheit der isolierten DNA: Durchschnittliches A260-/A280-Verhältnis: 1,7 - 1,9

Anwendung

Das DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut ermöglicht die Aufreinigung von DNA, die am besten für molekularbiologische Anwendungen geeignet ist:

• PCR/Lange PCR
• Sequenzierung
• Restriktionsverdau
• Southern Blots
• Klonierung

Das DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut wurde verwendet für die Isolierung von genomischer DNA aus dem Blut von Asthmapatienten für die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung.

Leistungsmerkmale und Vorteile

• Mehrere Proben können gleichzeitig verarbeitet werden.

Die Aufreinigung der DNA ist einfach und dauert nur <90 Minuten (plus 30 bis 60 Minuten für die Resuspendierung).

• Verwendung eines kosteneffizienten Kits.

Schnellere DNA-Aufreinigung für die gleichen Kosten wie die meisten Homebrew-Methoden.

• Erhalt konstanter und zuverlässiger Ergebnisse.

Analyse verschiedener Probenvolumen (1 bis 10 ml) mit unterschiedlichen Leukozytenmengen.

• Erhöhte Sicherheit.

Es werden keine chaotropen Salze, schädlichen organischen Lösungsmittel und Säulenaufreinigungsschritte benötigt.

Komponenten

• Erythrozyten-Lysepuffer
• Leukozyten-Lysepuffer
• Proteinpräzipitationslösung

Qualität

Jede Kit-Charge wird einem Funktionstest unterzogen zur Prüfung der Fähigkeit zum Aufreinigen der DNA mit anschließender spezifischer Amplifikation von 4,8 kb tPA-Fragment mittels PCR unter Verwendung des Expand Long Template PCR-Systems. Das 4,8 kb tPA-Produkt wird mittels Elektrophorese auf Agarosegel visualisiert und mit den entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen verglichen. Eine einzelne 4,8 kb tPA-Bande mit einer mit der Positivkontrolle übereinstimmenden Intensität ist sichtbar. Die im Kit enthaltenen Puffer werden auch auf die Abwesenheit einer DNase-Kontamination geprüft. Jede Lösung wird mit 1 μg pBR322 DNA für 6 Stunden bei +37 °C inkubiert. Anschließend wird die DNA mittels Elektrophorese auf Agarosegel visualisiert und dann mit einer Positivkontrolle verglichen, um zu bestimmen, ob eine lineare oder gebrochene (nicked) Plasmid-DNA sichtbar ist.

Angaben zur Herstellung

Das DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut nutzt einen optimal geeigneten Erythrozyten-Lysepuffer für die Isolierung der Leukozyten aus dem Vollblut. Die Leukozyten werden in Gegenwart eines starken anionischen Detergens lysiert und die Proteine werden dann mittels Dehydratisierung und Fällung entfernt. Die aufgereinigte DNA wird anschließend durch Ethanolfällung wiedergewonnen.

Sonstige Hinweise

Abbildung 1: Amplifikation von großen DNA-Fragmenten aus Säugetierblut, das mit dem DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut präpariert wurde. Das DNA-Präparat stammte aus zwei Forschungsproben - eine mit 10 ml humanem Blut und die andere mit 10 ml Mausblut. Aliquote jedes DNA-Präparats wurden als Templates für die Amplifikation mehrerer Genfragmente verwendet, wozu das Expand Long Template PCR-System eingesetzt wurde. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert.
Linke Tafel: Gen-Fragmente, amplifiziert aus Humanproben
Spur 2, 3: tPA-Fragment (9,3 kb) amplifiziert aus 25 ng DNA
Spur 4, 5: tPA-Fragment (15 kb) amplifiziert aus 50 ng DNA
Spur 6, 7: β-Globin-Fragment (23 kb) amplifiziert aus 100 ng DNA
Spur 8, 9: β-Globin-Fragment (28 kb) amplifiziert aus 200 ng DNA
Spur 1, 10: DNA-Molekulargewichtsmarker III
Rechte Tafel: Gen-Fragmente, amplifiziert aus Mausproben
Spur 2, 3: - IL-2 Gen (4,2 kb) amplifiziert aus 330 ng DNA
Spur 4, 5: α-2-Collagen-Fragment (5,6 kb) amplifiziert aus 100 ng DNA
Spur 6, 7: α-2-Collagen-Fragment (10,4 kb) amplifiziert aus 50 ng DNA
Spur 8, 9: α-2-Collagen-Fragment (15,4 kb) amplifiziert aus 100 ng DNA
Spur 1, 10: DNA-Molekulargewichtsmarker III

Abbildung 2: Southern Blot-Analyse der DNA aus verschiedenen Humanblutproben, die mit dem DNA-Isolierungs-Kit für Säugetierblut präpariert wurden. Die DNA wurde aus mehreren Forschungsproben präpariert, u. a. aus verschiedene Antikoagulanzien enthaltendem Humanblut sowie aus Lymphozyten- und Buffy-Coat-Präparationen. Zehn μg jeder Präparation wurden mittels Eco RI verdaut, durch Gelelektrophorese getrennt und durch Southern Blotting in eine Nylonmembran transferiert. Das NRAS-Gen in jeder Probe wurde unter Verwendung einer DIG-markierten NRAS-Sonde nachgewiesen.
Spur 2, 3: Natriumcitrat enthaltende Blutprobe
Spur 4, 5: Heparin enthaltende Blutprobe
Spur 6, 7: Natrium-EDTA enthaltende Blutprobe
Spur 8, 9: Buffy-Coat-Präparation
Spur 10, 11: Lymphozyten-Präparation
Spur 1, 12: DNA-Molekulargewichtsmarker VII
Ergebnis: Jede Spur enthielt nach der Hybridisierung eine einzelne Bande der erwarteten Größe.

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Sicherheitshinweise

• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash