Transfektion & Geneditierung
Transfektion ist der Prozess des Einbringens von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen. Zellen können zur Integration von DNA in ihr Genom stabil transfiziert oder zur temporären Proteinexpression transient transfiziert werden. Chemische, physikalische und biologische Methoden werden zur Transfektion von Zellen eingesetzt und ermöglichen die Untersuchung der Genfunktion und -expression innerhalb des Zellmilieus. Zu Anwendungen gehören Gentherapie, Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC), Genstummschaltung durch RNA-Interferenz (RNAi) und die Herstellung therapeutischer Antikörper und Proteine.
Zugehörige technische Artikel
- Transfection is the introduction of DNA, RNA, or proteins into eukaryotic cells and is used in research to study and modulate gene expression. Thus, transfection techniques and protocols serve as an analytical tool that facilitates the characterization of genetic functions, protein synthesis, cell growth and development.
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- Small inhibitory RNAs (siRNAs) have become the focus of interest in many laboratories. For the first time, these molecules offer an easy way to knock down the expression of selected genes in mammalian cells without having to resort to classical gene knockout techniques.
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Zugehörige Protokolle
- Our Universal Transfection Reagent is a unique formulation of a proprietary polymer blend used for transient and stable transfection of nucleic acids into various eukaryotic cell lines and hard-to-transfect primary cells. This is a fast and easy protocol is compatible with serum, serum-free medium and antibiotics.
- Protocols for Transfecting Common Cell Lines with X-tremeGENE™ Transfection Reagents
- Cell preparation for transfection Plate cells approx. 24 hours before transfection making sure cells are at optimal concentration (70 – 90 % confluency).
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- Product manual provides detailed protocol for easy DNA transfection.
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Gebräuchliche Transfektionsmethoden
- Lipide und Liposomen: Kationische Lipide bilden Liposome, die DNA oder RNA für den Transfer enthalten. Diese Liposomen fusionieren mit der Zellmembran und setzen Nukleinsäure in die Zelle frei.
- Calciumphosphat: Calciumphosphat erleichtert die Bindung von DNA an die Zelloberfläche, sodass genetisches Material durch Endozytose in die Zelle gelangen kann.
- Kationische Polymere: Bei der polymerbasierten Transfektion bildet exogene DNA Komplexe mit kationischen Polymeren wie Polyethylenimin (PEI), die durch Endozytose in die Wirtszellen aufgenommen werden.
- Lentivirale Transduktion: Zellen werden mit modifizierten Lentivirus-Vektoren infiziert, die ihre virale RNA in doppelsträngige DNA umwandeln, die für den Transfer in das Wirtsgenom integriert wird.
- Mikroinjektion: Zielzellen werden zunächst unter einem Mikroskop positioniert. Danach wird Nukleinsäure mithilfe einer feinen Glaskapillarnadel direkt in das Zytoplasma oder in den Kern injiziert.
- Elektroporation: Zellen werden einem intensiven elektrischen Strom ausgesetzt, der ihre Membranen destabilisiert und ihre Permeabilität für den Gentransfer erhöht.
Transfektion wird routinemäßig in Verfahren zur Geneditierung und Genstummschaltung eingesetzt, die unser Verständnis der komplexen biologischen Prozesse vertieft und die Anwendung von Gentherapeutika zur Behandlung von Krankheiten ermöglicht haben.
- CRISPR-Cas-Systeme nutzen einen bakteriellen Verteidigungsmechanismus aus, bei dem genetische CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) gekoppelt mit Cas(CRISPR-associated)-Endonukleasen eingesetzt werden, um genomische DNA an spezifischen Positionen zu schneiden und Gene in vivo zu entfernen oder zu ersetzen.
- Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) werden aus DNA-bindenden Domänen und Endonukleasen hergestellt und spalten DNA an definierten Stellen zur Geneditierung.
- RNAi-Reagenzien wie kurze Haarnadel-RNA (shRNA) und kurze interferierende RNA (siRNAs) limitieren die Gentranskriptmenge für die Genstummschaltung, indem sie entweder die Transkription unterdrücken oder sequenzspezifische RNA-Abbauprozesse aktivieren.
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