Zellwachstum & -erhaltung
Die Zellkultur ist eine grundlegende Technik, die in der biowissenschaftlichen Forschung eingesetzt wird, um relevante biologische Modelle zu erstellen oder rekombinante Proteine, Viruspartikel oder biologische Therapien herzustellen. Das Wachstum und die Erhaltung von kultivierten Zellen wie Bakterien, Hefen und Säugerzellen erfolgt in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (BSC, oft als Zell- oder Gewebekulturhaube bezeichnet) unter Verwendung geeigneter steriler Techniken, um eine mikrobielle und chemische Kontamination zu verhindern.
Zellkulturarten
Zwei der bekanntesten Ansätze für Säugerzellkulturen sind die Primärkultur und die kontinuierliche Kultur. Primärkulturen werden direkt aus menschlichem oder tierischem Gewebe gewonnen. Die Lebensdauer in der Kultur wird durch die zelluläre Seneszenz begrenzt ist. Kontinuierliche Kulturen gelten in Kultur als „unsterblich“, da sie häufig aus Tumorgewebe von Patienten gewonnen werden. Zelllinien können auch durch Immortalisierung von Zellen erzeugt werden und können seriell vermehrt oder für zahlreiche Zellteilungszyklen bzw. unbegrenzt passagiert werden.
Zugehörige technische Artikel
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Zugehörige Protokolle
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Zellen können in Suspension oder als 2D-Monolayer kultiviert werden, der an der Gewebekulturflasche oder Multiwell-Platte anhaftet. Die Kulturmethode wird durch das Ursprungsgewebe der Zellen bestimmt; Zellen aus Blut wachsen im Allgemeinen in Suspension, während Zellen aus festem Gewebe in der Regel in Monolayern wachsen.
Bei 3D-Zellkulturmodellen (Organoiden und Sphäroiden) wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass sie die In-vivo-Umgebung der Zellen besser nachahmen als Zellen, die auf 2D-Oberflächen gezüchtet werden. Sphäroide werden häufig aus Krebszelllinien oder Tumorbiopsien (von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle, PDX) als frei schwebende Zellaggregate in Platten mit ultraniedriger Anhaftung gebildet, während Organoide üblicherweise aus Gewebestammzellen gewonnen werden, die in eine ECM-Hydrogelmatrix eingebettet und dann differenziert werden.
Phasen des Zellwachstums
Die Sicherstellung eines adäquaten Zellwachstums ist entscheidend für die Erfassung genauer Daten aus Zellkulturstudien. Die Zellzahl kann mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler bestimmt werden, der genauere Zellzahlen liefert.
Das Zellwachstum in der Kultur verläuft im Allgemeinen in vier Phasen:
- Anlaufphase (Lag) - Die Zellen passen sich an die Kulturbedingungen an und teilen sich nicht.
- Exponentielle Phase (Log) - Die Zellen teilen sich aktiv, sodass dies die beste Phase ist, um das Populationswachstum zu bewerten oder Daten zu sammeln. Die späte Log-Phase ist der beste Zeitpunkt für das Passagieren (Subkultivierung) von Zellen.
- Stationäre Phase - Das Zellwachstum verlangsamt sich mit dem Erreichen einer 100%igen Konfluenz. In dieser Phase sind die Zellen am anfälligsten für Stress oder Verletzungen, da sich zellulärer Abfall ansammelt und die Ressourcen erschöpft sind.
- Absterbephase - Die Population der lebenden Zellen nimmt ab, da der Zelltod überwiegt.
Zellkulturmedien, Supplemente und Reagenzien
Gezüchtete Zellen benötigen für ihr Wachstum eine Versorgung mit Nährstoffen. Säugerzellkulturmedien müssen einen physiologischen pH-Wert aufrechterhalten und darüber hinaus ein ausgewogenes Verhältnis an Salzen, Kohlenhydraten, Aminosäuren, Vitaminen, Fettsäuren und Lipiden, Proteinen und Peptiden, Spurenelementen und Wachstumsfaktoren enthalten. Fötales Rinderserum (FBS) ist der am häufigsten verwendete Wachstumszusatz für die Säugerzellkultur, da es viele dieser wesentlichen Zellnährstoffe enthält und nachweislich das Wachstum von Zellen und Geweben in der Kultur fördert. Für Anwendungen, die definierte Medien oder reduzierte tierische Bestandteile erfordern, bieten sich xenofreie Medienformulierungen mit bekannter Zusammensetzung frei von tierischen Bestandteilen an.
Da Medien und Supplemente oft reichhaltige Nährstoffe für das Wachstum opportunistischer Mikroben liefern, sind aseptische Verfahren für eine erfolgreiche Zellkultur sowie die regelmäßige Kontrolle erforderlich, um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen vorhanden sind, die zum Zelltod führen oder das in-vivo-ähnliche Wachstum beeinträchtigen können. Bei häufig auftretenden, mikroskopisch nicht erfassbaren mikrobiellen Verunreinigungen schützt ein Routine-Screening mit Reagenzien zum Nachweis von Mykoplasmen die Kulturen und die Umgebung der Gewebevermehrung.
Hefekulturen wie S. cerevisiae und P. pastoris (Pichia) werden in der Forschung häufig für Untersuchungen der rekombinanten Protein-Expression und Genfunktion verwendet. Wichtige Nährstoffe, die in der Regel in einem Hefenährmedium enthalten sind, sind Pepton, Hefeextrakt und Dextrose oder Glukose.
Tipps und Tricks für das Passagieren von Zellen
Das Passagieren von Zellen ist ein grundlegender Schritt allgemeiner Zellkulturverfahren zur Aufrechterhaltung von Zellgesundheit und optimalem Zellwachstum. In diesem Tutorial wird der Prozess der Zellpassage, einschließlich der Bedeutung von Konfluenz und Zelldichte erläutert. Das Protokoll für die Zellpassage umfasst Prozesse wie die Überwachung und Zählung von Zellen, die Trypsinierung oder Dissoziation von Zellen und die erneute Aussaat der Zellen in neue Kulturgefäße.
Zellkulturumgebungen und Kulturgefäße
Für die Kultivierung und Handhabung von Zellen werden sterile Einweg-Kunststoffbehälter verwendet, darunter Gewebekulturflaschen und Multiwell-Platten, serologische Pipetten, sterile Flaschenaufsatzfilter und sterile Spritzenvorsatzfilter. Gewebekulturflaschen und -platten aus Kunststoff werden in der Regel so behandelt, dass sie eine hydrophile Oberfläche aufweisen, die das Anhaften adhärenter Zellen erleichtert. Als Alternative zu 2D-Oberflächen bieten Platten auf Basis mikroporöser Membranen eine physiologischere Wachstumsumgebung für komplexe Zellassays wie Zellmigration, Zell-Zell-Kommunikation und Zellpolarisation.
Die kultivierten Zellen müssen bei einer Temperatur und in einer Gasumgebung gehalten werden, die diese Parameter entsprechend dem Organismus, aus dem sie stammen, nachbilden. Kulturgefäße, die Zellen und Medien enthalten, werden in der Regel in Inkubationsgeräten aufbewahrt, die eine genaue Kontrolle der Temperatur und der Gasgemische ermöglichen. Kleine Benchtop-Inkubationssysteme, in denen Mikrofluidik eingesetzt und die Bildgebung von Zellen in ununterbrochener Kultur ermöglicht wird, können jedoch die authentischsten Umgebungen für prädiktive In-vitro-Modelle bieten.
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