Anwendungen der Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein leistungsstarkes molekularbiologisches Verfahren, das eine effiziente und schnelle In-vitro-Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen unterschiedlicher Herkunft bereitstellt. Eine Standard-PCR besteht aus Ziel-DNA, einem synthetischem Oligonukleotid-Primer-Set, das die Ziel-DNA-Sequenz flankiert, einer thermostabilen DNA-Polymerase (normalerweise Taq-Polymerase) und Nukleotiden. Jeder im Thermocycler durchgeführte Amplifikationszyklus besteht aus drei Schritten: Denaturierung doppelsträngiger DNA (dsDNA) zu separater einzelsträngiger DNA, Annealing von Primern an die Ziel-DNA-Sequenz und Extension, bei der DNA-Polymerase die DNA von den Primern verlängert und eine neue dsDNA mit einem alten und einem neuen Strang bildet. Die in einem Zyklus synthetisierten Stränge dienen als Template für den nächsten, sodass in nur 20 Zyklen eine millionenfache Vermehrung der DNA-Menge erzielt wird.

Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)

Die RT-PCR, oder Reverse-Transkriptase-PCR, ist eine Variation des Standard-PCR-Verfahrens, das die Amplifikation spezifischer mRNA aus sehr kleinen Proben beinhaltet. Sie eliminiert die Notwendigkeit für den mühseligen mRNA-Aufreinigungsprozess, der für konventionelle Klonierungsmethoden erforderlich ist. Bei der RT-PCR werden zusätzlich zu den Standard-PCR-Reagenzien eine reverse Transkriptase und eine RNA-Probe verwendet. Die Reaktionsmischung wird auf 37 ˚C erwärmt, wobei eine komplementäre cDNA-Kopie der RNA-Probe durch reverse Transkriptase hergestellt werden kann. Diese cDNA annealiert dann mit einem der Primer, wonach die Erststrang-Synthese erfolgt. Ab diesem Schritt wird dann die Standard-PCR durchgeführt, bei der letztendlich die dsDNA erzeugt wird. Die RT-PCR wird häufig mit Echtzeit-PCR (qPCR) kombiniert, die verbreitet zur Quantifizierung der Transkriptmenge in Zellen und Geweben eingesetzt wird.

Heißstart-PCR

Heißstart-PCR ist eine Technologie, die Heißstart-Taq-Polymerase oder den Einbau modifizierter dNTP beim Reaktionsaufbau hemmt, bis eine Hitzeaktivierung stattfindet. Es gibt verschiedene Methoden zur Hemmung der Heißstart-Polymeraseaktivität, wie z.B. chemische Modifikation, antikörpervermittelte und aptamervermittelte Methoden.

Endpunkt-PCR für lange und präzise Zielamplifikation

Die Endpunkt-PCR wird zum Nachweis des Vorhandenseins von Zielsequenzen und der relativen Abundanz am Ende der Reaktion eingesetzt. Die begrenzte Länge von etwa 5 kb der bei der Standard-PCR hergestellten Sequenzen wird zum Teil durch den Einbau zusätzlicher Faktoren gelöst, die eine „Korrekturleseaktivität“ bereitstellen. Bei der LA- (long and accurate) PCR wird eine zweite thermostabile Polymerase mit 3′→5′ Exonuklease zur Reparatur fehleingebauter terminaler Nukleotide eingesetzt. Dadurch wird eine deutlich höhere Genauigkeit und die Fähigkeit zur Amplifikation von DNA-Zielsequenzen bis zu einer Länge von 40 kb erzielt.

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