Markierung & Detektion von Nukleinsäuren
Es gibt zahlreiche Methoden zur Markierung und Detektion von Nukleinsäuren, PCR-Produkten und Oligonukleotiden. Die Reagenzien und Methoden, die oftmals zur Markierung und Detektion von Nukleinsäuren eingesetzt werden, hängen von verschiedenen Faktoren wie der Art des zu markierenden Moleküls und der nachfolgenden Anwendung ab. Folglich werden sowohl enzymatische als auch chemische Methoden zur Markierung von Nukleinsäuren und zum Einbau von verschiedenen Molekülen wie Fluorophoren, Enzymen und radioaktiven Elementen eingesetzt.
MARKIERUNG VON NUKLEINSÄUREN UND SONDEN
Nukleinsäuren können im gesamten Molekül oder an den 5'- und 3'-Enden markiert werden. Nukleinsäuresonden sind besonders nützlich für Hybridisierungsassays, wie z. B. für den Nachweis von RNA in einem Northern Blot oder von DNA in einem Southern Blot. Es gibt verschiedene Markierungsmethoden, um die Markierung in der gesamten Sonde zu verteilen, darunter PCR mit markierten Desoxynukleotiden (dNTP) oder Nukleotidtriphosphaten (NTP), Zufalls-Priming und Nick-Translation. Die Endmarkierung ist besonders nützlich für Assays zur Untersuchung von Nukleinsäure-Protein-Wechselwirkungen, um sterische Behinderungen zu vermeiden.
Assays zur Markierung und Detektion von Nukleinsäuren
Abhängig von der Markierungsmethode wird die kolorimetrische Detektion oftmals für enzymmarkierte Sonden eingesetzt, während die autoradiographische Detektion für radioaktive Sonden geeignet ist. Gebräuchliche Sonden umfassen Digoxigenin(DIG)- und Fluorescein-markierte Sonden, die zusammen eingesetzt werden können, um die Mehrfarben-Sondendetektion in Verbindung mit kolorimetrischen Reaktionen (z.B. alkalische Phosphatase) zu erleichtern. Ähnlich kann Biotin-16-dUTP mit PCR ebenfalls mit den meisten DNA-Polymerasen als zusätzliche Markierungs- und Detektionsmethode eingesetzt werden. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung werden fluoreszente Sonden zur Detektion von DNA-Sequenzen eingesetzt. Die erfolgreiche Detektion und nachfolgende Analyse ist teilweise von der Empfindlichkeit und Auflösung des verfügbaren Fluoreszenzmikroskops abhängig.
Anwendungen mit markierter DNA und RNA
Die Übertragung von Makromolekülen auf Festphasemembranen wird als Blotting bezeichnet. Aufgrund der Spezifität markierter Sonden ermöglicht die Hybridisierung der Nukleinsäure und der Sonde Wissenschaftlern den Nachweis sowohl von DNA- als auch RNA-Sequenzen in komplexen Nukleinsäuregemischen. Diese Methoden ermöglichen je nach Assay auch die Sammlung weiterer wertvoller Informationen wie die Analyse der Genexpression, der mRNA-Größe und der Kopienzahl. Die In-situ-Hybridisierung wird von Wissenschaftlern auch häufig zur Detektion einer oder mehrerer unterschiedlich markierter Sonden (z.B. DIG- und fluoreszenzmarkierter Sonden) eingesetzt.
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