Gelelektrophorese

Die Protein-Gelelektrophohese dient zur Trennung von Proteinen zu deren Aufreinigung, Charakterisierung und Detektion. Bei dieser Methode werden geladene Proteinmoleküle von einem elektrischen Feld durch ein Gel transportiert. Ihre Mobilität durch das elektrische Feld hängt von der Größe, Form und Ladung des Proteins ab.

Sowohl Polyacrylamid- als auch Agarose-Gelmatrizen können in der Protein-Elektrophorese verwendet werden. Diese Matrizen dienen als Sieb und lassen kleinere Proteine schneller wandern als größere. Agarose besitzt eine große Porenweite und kann zur Trennung von Proteinen mit einem Radius von 5-10 nm, wie ihn große Proteinkomplexe aufweisen, eingesetzt werden. Polyacrylamid besitzt eine kleinere Porengröße, kann Proteine zwischen 5 und 2000 kDA trennen und wird am häufigsten in der Proteinelektrophorese eingesetzt.

Es gibt mehrere Methoden der Protein-Gelelektrophorese, die jeweils bestimmte Informationen über Zielproteine liefern:

• SDS-PAGE
• Native PAGE
• Isoelektrische Fokussierung (IEF)
• 2D-PAGE

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SDS-PAGE

Die Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ermöglicht die Trennung von Proteinen nach Molekülmasse. Bei dieser Methode wird dem Laufpuffer SDS-Detergenz zugegeben. Das SDS verleiht den Proteinen eine negative Ladung und maskiert ihre intrinsische Ladung. Wenn Proteine in Gegenwart von SDS und Denaturierungsmitteln getrennt werden, werden sie weniger globulär und mehr linear. Aus diesem Grund ist die Geschwindigkeit, mit der SDS-gebundene Proteine durch das Gel wandern abhängig von ihrer Größe, sodass ihr Molekulargewicht durch Vergleich mit Proteinstandards abgeschätzt werden kann.

Native PAGE

Bei der nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Proteine so getrennt, dass ihre native Konformation (Tertiärstruktur), die Wechselwirkungen von Untereinheiten (Quartärstruktur und Protein-Protein-Interaktionen) und ihre biologische Aktivität erhalten bleiben. Bei dieser Methode werden Proteine unter nicht-reduzierenden, nicht-denaturierenden Bedingungen vorbereitet und verarbeitet. Die Proteinmobilität wird durch eine komplexe Kombination von Faktoren bestimmt, da jedes Protein abhängig von seiner Ladung auf jede der Elektroden zuwandern kann, wobei die Geschwindigkeit von seiner Form und seinem Bindungsverhalten abhängt. Aus diesem Grund wird die native PAGE nicht zur Bestimmung des Molekulargewichts empfohlen. Die native PAGE wird typischerweise in Anwendungen eingesetzt, die eine Aufreinigung von aktivem Protein oder die Detektion durch einen Antikörper, der nur die native Form des Proteins erkennt, erfordert.

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Bei der isoelektrischen Fokussierung wird sowohl ein elektrisches Feld als auch ein pH-Gradient eingesetzt, um Proteine nach ihrem nativen isoelektrischen Punkt (pI) zu trennen. Während Proteine durch den pH-Gradienten wandern, ändert sich ihre Nettoladung. In einem elektrischen Feld wandert jedes Protein zu dem pH-Wert, an dem seine Nettoladung Null beträgt (was als isolelektrischer Punkt des Proteins bezeichnet wird). Während des Trennverfahrens sammeln sich Proteine („fokussieren“) in der Probe an spezifischen und vorhersagbaren Stellen im Gel an. Die isoelektrische Fokussierung wird bei der Proteinidentifizierung in komplexen Proben (z.B. Zell- und Gewebelysaten, Plasma), bei der Analyse posttranslationaler Modifikationen und bei der Auftrennung von Proben für die massenspektrometrische Analyse eingesetzt.

2D-PAGE

Die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermöglicht die Trennung von Proteinen sowohl nach ihrem instrinsischen isoelektrischen Punkt (pI) als auch nach Masse. Die Trennung nach pI erfolgt durch isoelektrische Fokussierung (IEF). Die Trennung nach Masse erfolgt durch SDS-PAGE. Die 2D-PAGE bietet die beste Auflösung für die Proteinanalyse und wird häufig in der Proteomforschung zur Auftrennung hunderter bis tausender von Proteinen auf einem einzigen Gel eingesetzt.