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Proteinaufreinigung

Proteinaufreinigung

Verschiedene Proteinaufreinigungsmethoden werden sowohl in der biologischen als auch der biomedizinischen Forschung verbreitet eingesetzt. Die Arbeitsabläufe bei der rekombinanten Proteinexpression und -aufreinigung hängen von vielen Variablen ab. Dazu gehören u.a. die physikalischen Eigenschaften und die biologische Funktion des Proteins und ob für die Expression des Zielproteins eine bakterielle oder eukaryotische Zelllinie verwendet werden soll. Im Bereich der rekombinanten Proteinexpression und -aufreinigung wurden bedeutende Fortschritte erzielt und unzählige Systeme und Kits entwickelt, die kommerziell erhältlich sind. Proteine sind jedoch komplexe Makromoleküle, und optimale Strategien zur Proteinexpression und -aufreinigung müssen empirisch bestimmt werden.

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Wichtige Faktoren für die Proteinaufreinigung

Die Proteinstruktur und die Proteinfunktion sind oftmals wichtige Faktoren bei der Auswahl einer Aufreinigungsstrategie. Die biochemische und biologische Aktivität rekombinanter Proteine wird teilweise durch diskrete Domänen innerhalb des Proteins bestimmt, die oftmals von der Faltung des Proteins in sekundäre, tertiäre und quartäre Strukturen abhängen.

Proteinfaltung wird kollektiv als Struktur höherer Ordnung (HOS) bezeichnet und ist ausschlaggebend für die korrekte dreidimensionale Form und die Funktion des Proteins. Außerdem ist die Proteinlöslichkeit ein sehr wünschenswertes Merkmal für eine erfolgreiche Proteinaufreinigung und wird durch zahlreiche Faktoren wie Größe und N- und C-terminale Elemente beeinflusst. Rekombinante Proteine enthalten normalerweise N- und C-terminale Tags, d.h. kleine Sequenzen, die je nach spezifischem Tag und vorgesehener Downstream-Anwendung zur immunhistochemischen Detektion und Aufreinigung oder Proteinaffinitätschromatographie eingesetzt werden.

Methoden und Anwendungen der Proteinaufreinigung

Wissenschaftler haben sowohl für die Untersuchung der Proteinfunktion als auch für das Scale-up der Proteinaufreinigung für die industrielle Biologika- und Pharmazeutikaproduktion zahlreiche Proteinaufreinigungsmethoden, Reagenzien und Arbeitsmittel zur Verfügung. Der Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung wird teilweise durch die gewählte Proteinaufreinigungsmethode bestimmt. Affinitätschromatographie ist ein geeigneter erster Schritt zur Aufreinigung gelöster rekombinanter Proteine mit relevanten Tags. Jedoch binden wahrscheinlich auch unerwünschte Proteine an die Affinitätsharzsäule und werden im letzten Waschschritt zusammen mit dem gewünschten Zielprotein eluiert. Wenn eine weitere Aufreinigung erforderlich ist, werden zusätzliche Aufreinigungsstrategien wie Größenausschlusschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie eingesetzt. Wichtig ist dabei, dass viele Affinitätstags entfernt werden können, da Wissenschaftler ggf. alle nicht-nativen Sequenzen aus dem aufgereinigten Protein entfernen möchten.

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