THIFICDNARO

Transcriptor High Fidelity cDNA-Synthesekit

sufficient for 50 reactions, sufficient for 100 reactions, sufficient for 200 reactions, suitable for RT-PCR, suitable for RT-qPCR

• UNSPSC-Code: 41106313
• NACRES: NA.55

Eigenschaften

• Verwendung: sufficient for 100 reactions; sufficient for 200 reactions; sufficient for 50 reactions
• Qualitätsniveau: 100
• Leistungsmerkmale: hotstart: no
• Hersteller/Markenname: Roche
• Verpackung: pkg of 100 reactions (05091284001); pkg of 200 reactions (05081963001); pkg of 50 reactions (05081955001)
• Methode(n): RT-PCR: suitable; RT-qPCR: suitable
• Aufnahme: purified RNA
• Nachweisverfahren: probe-based

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Enzymmischung der reversen „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase für die hochgenaue zweistufige PR-PCR von RNA bis zu 14 kb.

Die Kernkomponente des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits ist die reverse „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase, eine Mischung aus einer rekombinanten reversen Transkriptase und einem bei der Korrekturlesung vermittelnden Enzym. Der Synergieeffekt zwischen den beiden Enzymen ist der Schlüssel zur Fähigkeit der Enzymmischung, die RNA-Templates mit im Vergleich zu anderen herkömmlichen reversen Transkriptasen 7-mal höherer Genauigkeit revers zu transkribieren.
Die Enzymmischung der reversen „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase kann Templates bis zu 14 kb effektiv revers transkribieren. Aufgrund der hohen Wärmeformbeständigkeit der beiden Enzymkomponenten und dem speziell optimierten Puffersystem ist reverse Transkription bei Temperaturen bis zu +55 °C möglich. Auf diese Weise können auch GC-reiche Templates mit hoher Sekundärstruktur revers transkribiert werden, ohne erforderliche Verwendung von Additiven, die sich negativ auf die Genauigkeit der reversen Transkriptasereaktion auswirken könnten.

Die in der Enzymmischung enthaltene rekombinante reverse Transkriptase wird in E. coli exprimiert. Das Enzym verfügt über RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität, abwickelnde Aktivität und RNase-H-Aktivität, die RNA in RNA:DNA-Hybride zerlegt. Letztere führt dazu, dass keine zusätzliche, zeitraubende RNase-H-Inkubation in einem gesonderten Schritt nach der reversen Transkriptase erforderlich ist, wodurch Zeit und Kosten gespart werden.

Im „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekit sind alle für die Erst-Strang-cDNA-Synthesereaktionen erforderlichen Reagenzien enthalten. Für das Priming können drei verschiedene Primersysteme verwendet werden. Im Kit sind zwei cDNA-Synthese-Primer enthalten: ein Hexamer-Zufallsprimer und ein Primer mit eingebettetem Oligo(dT)₁₈. Letzterer dient dazu, sich an den Anfang der Poly(A)-Kette zu binden, um eine vollständige cDNA herzustellen und ein Priming über interne Stellen auf der Poly(A)-Kette zu vermeiden. Die 5′-Enden langer mRNAs sind oft unterrepräsentiert, weshalb diese Priming-Methode bei den meisten Anwendungen vorgezogen wird. Die Verwendung von Hexamer-Zufallsprimern ermöglicht das Priming über die gesamte Länge der RNA hinweg und sorgt für die einheitliche Repräsentation aller RNA-Sequenzen. Zudem wird die reverse Transkription von RNA ermöglicht, die nicht über eine Poly(A)-Kette verfügen. Der thermostabile „Protector RNase-Inhibitor“ (im Kit enthalten) schützt die RNA vor der Zersetzung bei hohen Reaktionstemperaturen.

Retrovirale reverse Transkriptasen, die üblicherweise für die cDNA-Synthese verwendet werden, weisen eine höhere Fehlerrate auf als andere DNA-Polymerasen, die für Verfahren zur Nukleinsäureanalyse verwendet werden. Die mangelnde Genauigkeit resultiert in einer hohen Anzahl von Basenaustauschen oder Rasterverschiebungen, die in darauffolgenden PCR-Reaktionen noch weiter vermehrt werden. Hochpräzise (Korrektur lesende) PCR-Enzyme stehen schon seit Jahren zur Verfügung, aber die neue, ebenfalls hochpräzise reverse Transkriptase von Roche ist zudem in der Lage, eine hohe Menge cDNA in voller Länge zu synthetisieren.
Eine hohe Mutationsrate ist ein Kennzeichen der Replikation von Retroviren. Diese ist auf den Mechanismus der Genomreplikation durch die viralkodierte reverse Transkriptase zurückzuführen, die genomische RNA des Virus in eine dsDNA umwandelt. Während dieser Phase entstehen bei der reversen Transkription zahlreiche Replikationsfehler. Eine akzeptierte Erklärung dieser Fehlerhaftigkeit ist der Mangel an RT 3′-5′-Exonukleaseaktivität. Die natürlich hohe Fehlerrate reverser Transkriptasen ist bei zahlreichen Anwendungen unerwünscht.

Anwendung

Das „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekit wurde konzipiert für die reverse Transkription von RNA mit höherer Genauigkeit als es mit anderen reversen Transkriptasen möglich ist. Das Kit enthält eine reverse „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase, eine Mischung aus einer rekombinanten reversen Transkriptase und einem bei der Korrekturlesung vermittelnden Enzym, die für die zweistufige RT-PCR optimiert wurde. Deshalb ist dieses Produkt hervorragend geeignet für:

• Klonen bestimmter Gene
• Sequenzierung von Transkriptomen
• Erstellung von cDNA-Bibliotheken mit großen Einfügungen und Einfügungen in voller Länge
• Generieren von Analysen zur Genexpression, wie RNA-Spleißanalyse

Da dieses Kit auch mit den LightCycler^®-Instrumenten und anderen Echtzeit-PCR-Geräten getestet wurde, eignet sich das Produkt zudem hervorragend für quantitative RT-PCR, bei denen hohe Genauigkeit benötigt wird.
Das Kit enthält alle Komponenten, die für die Synthese von cDNA zur direkten Verwendung in qualitativen RT-PCR mit konventionellen Thermocyclern oder quantitativen RT-PCR mit Echtzeit-PCR-Geräten erforderlich sind. Die Packung für 50 Reaktionen enthält zudem 10 Kontrollreaktionen (Kontroll-RNA und Kontroll-Primermischung).

Leistungsmerkmale und Vorteile

Steigert die Genauigkeit bei reversen Transkriptionsreaktionen.

• Sie profitieren von einer optimierten Enzymmischung mit 7-mal höherer Genauigkeit im Vergleich zu anderen herkömmlichen reversen Transkriptasen.
• Sie erhalten hoch genaue Daten, die auf die Sequenzierung mehrerer Millionen Basen mithilfe des „Genome Sequencer 20“-Systems zurückgehen.

Auf diese Weise wird Genauigkeit mit hoher Empfindlichkeit, hoher Ergiebigkeit und Transkripten in voller Länge kombiniert.

• Sie können Transkripte voller Länge mit bis zu 14 kb erstellen, indem Sie die im Kit enthaltenen Primer mit eingebettetem Oligo (dT)₁₈ verwenden.
• Sie erhalten exzellente Erträge.
• Es können niedrige Kopienzahlen der Templates nachgewiesen werden und es kann von nur 10 pg Template-RNA revers transkribiert werden.
• Es ist eine Transkription verschiedener Templates möglich, einschließlich als schwierig geltender (z. B., GC-reicher RNAs mit hoher Sekundärstruktur), bei Temperaturen bis zu +55 °C.

Ergebnisse werden schneller erzielt.

• Die Reaktionszeit bei der reversen Transkription kann auf bis zu 10 Minuten reduziert werden.
• Schnelle Ergebnisse

Komponenten

Lieferumfang des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits:

• Reverse „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase (Mischung aus einer rekombinanten reversen Transkriptase und einem bei der Korrekturlesung vermittelnden Enzym)
• „Transcriptor High Fidelity“-Reaktionspuffer, 5x konzentriert
• Protector RNase-Inhibitor
• dNTP-Mischung, PCR-Qualität
• Primer mit eingebettetem Oligo (dT)₁₈
• Hexamer-Zufallsprimer
• DTT
• Wasser, PCR-Qualität
• Kontroll-RNA: Gesamt-RNA-Anteil gereinigt von immortalisierter Zelllinie K-562*
• Kontroll-PBGD-Primermischung (Vorwärts- und Rückwärtsprimer)*

* Nur im Lieferumfang der Packung für 50 Reaktionen enthalten.

Qualität

Jede Charge im Kit wird mittels eines Assays zur Quantifizierung der Korrekturlesungsaktivität und eines zweistufigen qRT-PCR-Assays zur Quantifizierung der Gegenwart von PBGD-mRNA in der Gesamt-RNA von K-562-Zellen auf ihre Funktion getestet.

Sonstige Hinweise

Überblick über reverse Transkriptase

Abbildung 1: Genauigkeit der reversen „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase und einer herkömmlichen reversen M-MuLV-Transkriptase.
Die Fehlerrate wurde anhand der Sequenzierung mit dem „Genome Sequencer 20“-System ermittelt. RNA wurde mit der reversen „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase und einer herkömmlichen reversen M-MuLV-Transkriptase revers transkribiert. Nach dem Aufreinigen der cDNA und der Amplifikation mit einer Korrektur lesenden Polymerase wurde die Fehlerrate der reversen Transkriptasen durch Abziehen der Fehlerrate von mit Plasmid-DNA durchgeführten Polymerasekettenreaktion derselben Sequenz berechnet. Die Fehlerrate der reversen „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase stellt einen Mittelwert von vier unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten mit mindestens 3,1 x 10⁶ sequenzierten Basen dar. Bei der reversen M-MuLV-Transkriptase wurden 4,5 x 10⁶ Basen sequenziert.
Die Genauigkeit wird als Fehlerrate -1 dargestellt, was der durchschnittlichen Anzahl an Basen entspricht, die vor einem Transkriptionsfehler revers transkribiert wurden. Die reverse „Transcriptor High Fidelity“-Transkriptase weist höhere Genauigkeit als die standardmäßige reverse M-MuLV-Transkriptase auf, was zu einer niedrigeren Fehlerrate während der cDNA-Synthese führt.

Abbildung 2: Vergleich verschiedener reverser Transkriptasen für die reverse Transkription von Gesamt-RNA bei verschiedenen Fragmentgrößen.
Gesamt-RNA (1 μg Gesamt-RNA aus menschlichem Muskel für 2,3-kb-Fragment; 1 μg HeLa-Gesamt-RNA für 5,4-kb- und 9,4-kb-Fragmente; 2 μg Gesamt-RNA aus Rattengehirn für 12,4-kb-Fragment) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit verschiedenen reversen Transkriptasen revers transkribiert. 5-μl-Aliquote der einzelnen cDNA-Reaktionen wurden mithilfe des „Expand Long Range dNTPack“ von Roche amplifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass mithilfe des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits ein breites Spektrum an Fragmentgrößen mit höherer Ausbeute und höherer Genauigkeit effizient transkribiert werden kann als es mit den reversen Transkriptasen anderer Anbieter möglich ist.

Abbildung 3: Der Vergleich verschiedener Inkubationszeiten für cDNA-Reaktionen unter Verwendung des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits.
Ein Mikrogramm HeLA-Gesamt-RNA wurde bei +50 °C für die angegebene Dauer revers transkribiert. Fünf-Mikroliter-Aliquote der cDNA-Reaktionen wurden mithilfe des „Expand Long Range dNTPack“ von Roche mit Primern amplifiziert, um ein 8,5-kb-Fragment zu erhalten. Alle Reaktionen wurden doppelt durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass mithilfe des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits RNA mit hoher Geschwindigkeit und hoher Genauigkeit transkribiert werden kann.

Abbildung 4: Der Vergleich verschiedener Inkubationszeiten für cDNA-Reaktionen unter Verwendung des „Transcriptor High Fidelity“-cDNA-Synthesekits.
1 μg HeLA-Gesamt-RNA wurde bei +50 °C für die angegebene Dauer revers transkribiert. 5-μl-Aliquote der cDNA-Reaktionen wurden mithilfe des „Expand Long Range dNTPack“ von Roche mit Primern amplifiziert, um ein 8,5-kb-Fragment zu erhalten. Alle Reaktionen wurden doppelt durchgeführt

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Rechtliche Hinweise

LightCycler is a registered trademark of Roche

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS07
• Signalwort: Warning
• H-Sätze: H319
• P-Sätze: P264 - P280 - P305 + P351 + P338 - P337 + P313
• Gefahreneinstufungen: Eye Irrit. 2
• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash