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Manipulating gene expression and signaling activity in cultured mouse limb bud cells.

Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists (2014-03-19)
Jordan P Lewandowski, Taylor A Pursell, Adam H Rabinowitz, Steven A Vokes
ZUSAMMENFASSUNG

The vertebrate limb bud is a well-established system for studying the mechanisms driving growth and patterning of an embryonic tissue. However, approaches for manipulating gene expression are currently limited to time-consuming methods. Culturing primary limb bud cells could potentially be used as a quicker assay. However, limb cells in culture quickly differentiate into cartilage under normal conditions, and approaches delivering DNA and siRNA into primary limb cells in culture are limited. These technical limitations have restricted the utility of limb buds for investigating problems that require higher-throughput approaches. In this report, we describe adaptations to a method for culturing primary limb bud cells in a pre-chondrogenic state, and generate a population of mouse primary limb cells that are responsive to Hedgehog (Hh) signaling. Hh-stimulated cells upregulate Hh target genes as well as an exogenous Hh-responsive reporter. We then describe a method for highly efficient delivery of plasmids and siRNAs into cultured primary limb bud cells in a 96-well format. Cultures of primary limb bud cells are amenable to gene manipulation under conditions that maintain the limb cells in an Hh-responsive, undifferentiated state. This approach provides a medium-throughput system to manipulate gene expression, and test DNA regulatory elements.

MATERIALIEN
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Sigma-Aldrich
Kaliumphosphat, ACS reagent, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
Kaliumphosphat, powder, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
MISSION® siRNA-Universal-Negativkontrolle Nr. 1
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Ethylendiamintetraessigsäure -Lösung, 0.02% in DPBS (0.5 mM), sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
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Kaliumphosphat, for molecular biology, ≥98.0%
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Ethylendiamintetraessigsäure, anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
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Ethylendiamintetraessigsäure, 99.995% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Ethylendiamintetraessigsäure, ACS reagent, 99.4-100.6%, powder
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Sigma-Aldrich
Kaliumphosphat, BioUltra, for molecular biology, anhydrous, ≥99.5% (T)
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Kaliumphosphat, 99.99% trace metals basis
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Purmorphamine, ≥98% (HPLC)
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Sigma-Aldrich
Kaliumphosphat, ReagentPlus®
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Sigma-Aldrich
Ethylendiamintetraessigsäure, anhydrous, BioUltra, ≥99% (titration)
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USP
Monobasisches Kaliumphosphat, United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard
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Sigma-Aldrich
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz -Lösung, BioUltra, for molecular biology, pH 8.0, ~0.5 M in H2O
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Sigma-Aldrich
Ethylendiamintetraessigsäure, purified grade, ≥98.5%, powder
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Supelco
Kaliumphosphat, Pharmaceutical Secondary Standard; Certified Reference Material
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Sigma-Aldrich
Kaliumphosphat, tested according to Ph. Eur., anhydrous
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Sigma-Aldrich
Ethylendiamintetraessigsäure, ≥98.0% (KT)
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Ethylendiamintetraessigsäure, BioUltra, ≥99.0% (KT)
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MISSION® esiRNA, targeting mouse Cdk6
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Sigma-Aldrich
MISSION® esiRNA, targeting human CDK6
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