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  • Multiple UDP-glucuronosyltransferases in human liver microsomes glucuronidate both R- and S-7-hydroxywarfarin into two metabolites.

Multiple UDP-glucuronosyltransferases in human liver microsomes glucuronidate both R- and S-7-hydroxywarfarin into two metabolites.

Archives of biochemistry and biophysics (2014-12-03)
C Preston Pugh, Dakota L Pouncey, Jessica H Hartman, Robert Nshimiyimana, Linda P Desrochers, Thomas E Goodwin, Gunnar Boysen, Grover P Miller
RESUMEN

The widely used anticoagulant Coumadin (R/S-warfarin) undergoes oxidation by cytochromes P450 into hydroxywarfarins that subsequently become conjugated for excretion in urine. Hydroxywarfarins may modulate warfarin metabolism transcriptionally or through direct inhibition of cytochromes P450 and thus, UGT action toward hydroxywarfarin elimination may impact levels of the parent drugs and patient responses. Nevertheless, relatively little is known about conjugation by UDP-glucuronosyltransferases in warfarin metabolism. Herein, we identified probable conjugation sites, kinetic mechanisms and hepatic UGT isoforms involved in microsomal glucuronidation of R- and S-7-hydroxywarfarin. Both compounds underwent glucuronidation at C4 and C7 hydroxyl groups based on elution properties and spectral characteristics. Their formation demonstrated regio- and enantioselectivity by UGTs and resulted in either Michaelis-Menten or substrate inhibition kinetics. Glucuronidation at the C7 hydroxyl group occurred more readily than at the C4 group, and the reaction was overall more efficient for R-7-hydroxywarfarin due to higher affinity and rates of turnover. The use of these mechanisms and parameters to model in vivo clearance demonstrated that contributions of substrate inhibition would lead to underestimation of metabolic clearance than that predicted by Michaelis-Menten kinetics. Lastly, these processes were driven by multiple UGTs indicating redundancy in glucuronidation pathways and ultimately metabolic clearance of R- and S-7-hydroxywarfarin.

MATERIALES
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Sigma-Aldrich
Metanol, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Alcohol etílico puro, 200 proof, for molecular biology
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Sigma-Aldrich
Tetrahidrofuran, inhibitor-free, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Metanol, ACS reagent, ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Alcohol etílico puro, 200 proof, ACS reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Acetato de etilo, ACS reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, ACS reagent, ≥99.7%
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Metanol, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acetato de etilo, suitable for HPLC, ≥99.7%
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Sigma-Aldrich
Alcohol etílico puro, 200 proof, HPLC/spectrophotometric grade
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Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, ReagentPlus®, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Tetrahidrofuran, contains 200-400 ppm BHT as inhibitor, ACS reagent, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
Ácido perclórico, ACS reagent, 70%
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Sigma-Aldrich
Metanol, HPLC Plus, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acetato de etilo, HPLC Plus, for HPLC, GC, and residue analysis, 99.9%
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Sigma-Aldrich
Alcohol etílico puro, 200 proof, meets USP testing specifications
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Sigma-Aldrich
Alcohol etílico puro, for molecular biology
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution, for molecular biology, 1.00 M±0.01 M
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Sigma-Aldrich
Magnesium chloride, anhydrous, ≥98%
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Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, ≥99.99% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Metanol, suitable for HPLC, gradient grade, suitable as ACS-grade LC reagent, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, puriss., meets analytical specification of Ph. Eur., BP, USP, FCC, 99.8-100.5%
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