Procedura testu z trypsyną (EC 3.4.21.4)

Czytaj więcej

• Środki ostrożności
• wymagane odczynniki i sprzęt
• instrukcje przygotowania
• Procedura
• Wyniki
• Powiązane produkty
• Referencje

Ta procedura służy do oznaczania aktywności trypsyny przy użyciu estru etylowego N_α-benzoilo-L-argininy (BAEE) jako substratu. Procedura polega na ciągłym spektrofotometrycznym oznaczaniu szybkości (A₂₅₃, ścieżka światła = 1 cm) w oparciu o następującą reakcję:

BAEE + H2O+ Trypsyna

→

Nα-Benzoilo-L-arginina + etanol

gdzie:
BAEE = ester etylowy N_α-benzoilo-L-argininy

Definicja jednostki - Jedna jednostka BAEE aktywności trypsyny wytworzy ΔA₂₅₃ o wartości 0.001 na minutę z BAEE jako substratem przy pH 7,6 w temperaturze 25°C w objętości reakcji 3,20 ml.

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Wymagane odczynniki i sprzęt

Fosforan sodu, jednozasadowy (Nr kat. S0751)

N_αester etylowy benzoilo-L-argininy (BAEE, Nr katalog.B4500)

1&M roztwór NaOH

1 M kwas solny (Nr kat. 318949)

.Instrukcje przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (≥18 MΩxcm rezystywności w 25 °C).

Bufor (67 mM bufor fosforanu sodu, pH 7,6 w 25 °C) - Przygotuj roztwór o stężeniu 8.04 mg/ml roztworu przy użyciu fosforanu sodu, jednozasadowego  (nr katalogowy  S0751) w ultraczystej wodzie. Doprowadzić do pH 7,6 w temperaturze 25 °C za pomocą 1 M roztworu NaOH.

Roztwór substratu (0.25 mM estru etylowego N_α-benzoilo-L-argininy) - Przygotuj 0.086 mg/mL roztworu przy użyciu estru etylowego N_α-benzoilo-L-argininy (BAEE, nr kat. B4500) w buforze.

Roztwór HCl (1 mM kwas chlorowodorowy) - Przygotuj 1000-krotne rozcieńczenie  1 M kwasu chlorowodorowego roztworu  (Nr katalog. 318949) w ultraczystej wodzie.

Roztwór enzymatyczny (trypsyna) - Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 425-575 jednostek/ml trypsyny w zimnym (2-8 °C) roztworze HCl.

Procedura

W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,20 ml końcowe stężenia wynoszą 62.8 mM fosforanu sodu, 0.23 mM N_α estru etylowego benzoilo-L-argininy, 0.031-0.063 mM kwasu solnego, 42,5-115,0 jednostek trypsyny.

1. Odpipetuj następujące odczynniki do odpowiednich kuwet kwarcowych:

Odczynnik	Puste (mL)	Test (mL)
Roztwór substratu	3.00	3.00
Roztwór HCl	0.200	0.125

Uwaga: Przeprowadź test w trzech egzemplarzach.

2. Wymieszaj przez odwrócenie i wyrównaj do 25 °C za pomocą odpowiednio termostatowanego spektrofotometru. Następnie dodać:

Odczynnik	Puste (mL)	Test (mL)
Roztwór enzymu	-	0.075

Uwaga: Objętość końcowa w każdej kuwecie musi wynosić 3,2 ml na jednostkę definicji.

3. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A₂₅₃ przez 5 minut. Używając 1 minutowego okresu czasu i co najmniej 4 punktów danych, uzyskaj ΔA₂₅₃/minutę przy użyciu maksymalnej szybkości liniowej zarówno dla ślepej próby, jak i testów.

Wyniki

Obliczenia

1.

gdzie:
df = współczynnik rozcieńczenia
0,001 = zmiana A₂₅₃/minutę w oparciu o definicję jednostki
0.075 = objętość (mL) badanej próbki użytej w teście
Uwaga: Całkowita objętość w kuwecie nie jest używana w obliczeniach, ponieważ definicja jednostki opiera się na 3,2 mL.

2.

Units/mg solid =	. Units/ mL enzyme
	mg solid/mL enzyme

.

Referencje

1. Bergmeyer H. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. 2. New York: Academic Press, Inc..