Charakterystyka biofarmaceutyczna

Tożsamość

Określanie nienaruszonej masy

Określanie nienaruszonej masy molekularnej, często wykonywane przy użyciu SEC-MS i odpowiednich standardów, jest niezbędnym krokiem w charakterystyce leków biologicznych, od selekcji klonów po weryfikację produktu końcowego. Analiza nienaruszonej masy cząsteczkowej jest powszechnie stosowana do wykazania różnorodności produktów białkowych/peptydowych i weryfikacji tożsamości leków biologicznych. Dzięki optymalizacji może ona również określać nienaruszoną masę cząsteczkową wszystkich produktów białkowych, w tym bispecyficznych przeciwciał monoklonalnych.

Zamiast zajmować się nieporęczną nienaruszoną masą dużego białka biologicznego, stosuje się podejście analizy trawienia białek, w którym próbka jest najpierw rozszczepiana na kilka fragmentów, po czym separacja może być obsługiwana indywidualnie z specjalistycznymi standardami proteomiki masowej.

Pomiar miana

Produktywność linii komórkowej do dostarczania wystarczających ilości mAb wpływa na jej potencjał komercyjny. Używane jako pomiar wyjściowy, miano jest mierzone przy użyciu chromatografii powinowactwa białka-A (HPLC). Początkowo podczas opracowywania mAb, duża liczba próbek z hodowli komórek zbioru (HCC) miała być badana pod kątem miana IgG. Chromatografia powinowactwa wykorzystująca ligand białka A jest często stosowana do określania stężenia mAb, jak również do oczyszczania go w celu dalszej analizy agregatów i wariantów ładunku.

Analiza aminokwasów

Analiza aminokwasów jest popularnym sposobem ustalania tożsamości produktu i jest stosowana do określania składu aminokwasowego mAb. Jest często wykonywana wraz z pomiarem współczynnika ekstynkcji, metodą rutynowo stosowaną do ustalenia miana między różnymi produkcjami.

Certyfikowane materiały referencyjne z wartościami przypisanymi przez metrologicznie ważne procedury będą miały kluczowe znaczenie dla zminimalizowania i kontrolowania zmienności eksperymentalnych na wszystkich etapach analizy aminokwasów, w tym ekstrakcji białek, frakcjonowania, wzbogacania, proteolizy i analizy.

Mapowanie peptydów

Aby uzyskać wskazanie tożsamości mAb, wystarczające może być porównanie prostych map peptydów pojedynczego enzymu. Bardziej szczegółowa charakterystyka przeciwciał terapeutycznych, w tym sekwencjonowanie N- lub C-końcowe, charakterystyka glikanów i inne aspekty produkcji, analizy, oczyszczania i fragmentacji przeciwciał mogą lepiej informować o inżynierii produktu. Proteomiczna spektrometria mas dostarcza dodatkowych informacji strukturalnych.

Post-translational Modification

N-glycan Analysis

Wysoko zmienna glikozylacja może wpływać na czystość mAb i powodować zmienną funkcję. Przeciwciała monoklonalne zawierają N-glikany na swoim szkielecie, które mogą być uwalniane przy użyciu LC-MS w celu oceny wzorców glikozylacji. Charakterystyka N-glikanów z przeciwciała monoklonalnego jest konieczna, aby zapewnić pełne szczegóły strukturalne badanej cząsteczki. Zrozumienie tych szlaków N-glikanów jest ważne, ponieważ N-glikany wpływają na wiele właściwości glikoprotein, w tym ich konformację, rozpuszczalność, antygenowość i rozpoznawanie przez białka wiążące glikany.

Porównanie struktury wyższego rzędu (HOS) przeciwciał monoklonalnych

Wiele czynników wpływa na HOS - trójwymiarową strukturę mAb - począwszy od wyboru linii komórkowej do produkcji mAb po warunki bioprocesu, takie jak temperatura, pH i ekspozycja na światło. Spektrometria mas z wymianą deuteru wodoru (HDX-MS) jest metodą stosowaną do szczegółowego wglądu w trzeciorzędową strukturę mAb.

Analiza modyfikacji mAb

W trakcie procesu produkcji mAb może wystąpić wiele różnych modyfikacji potranslacyjnych, na które duży wpływ mają parametry procesu, takie jak media, temperatura itp. Aby uzyskać spójny produkt, niezwykle ważne jest, aby modyfikacje te były odtwarzane podczas każdej rundy syntezy mAb. Analiza modyfikacji obejmuje mapowanie mostków dwusiarczkowych i ocenę podstawowej struktury glikanu. Rozsądne jest również ilościowe określenie sialilacji, ponieważ kwas sialowy może mieć negatywny wpływ na mAb.

Rozkład ładunku mAb

W wyniku modyfikacji potranslacyjnych (PTM) lub modyfikacji chemicznych, warianty ładunku mogą mieć znaczący wpływ na aktywność biologiczną i farmakokinetykę mAb. Analiza wariantów ładunku, będąca wymogiem regulacyjnym dla mAb, może być oceniana za pomocą technik, w tym chromatografii kationowymiennej (CEX) i kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego (cIEF).

m Ab Physical Testing &Rozkład wielkości

Badania fizyczne mAb

Badania fizyczne są wykorzystywane do scharakteryzowania wyglądu mAb, na przykład pomiaru pH, osmolalności i stężenia. Integralność opakowania jest również oceniana w ramach protokołu badań fizycznych, na przykład przy użyciu analizy wilgotności Karla Fischera lub wnikania barwnika w celu potwierdzenia integralności zamknięcia.

Rozkład wielkości mAb

Chociaż pożądany jest pojedynczy produkt mAb, początkowy materiał produkcyjny często zawiera warianty wielkości, takie jak agregaty, fragmenty i biomolekuły wykazujące dodatkowe łańcuchy lekkie. Ponieważ mogą one potencjalnie wpływać na immunogenność i siłę działania, ważne jest monitorowanie ich obecności. Chromatografia wykluczania (SEC) jest najczęściej stosowaną metodą oceny rozkładu wielkości. 

Sterility & Impurities

Host-cell Protein Impurities

.Zanieczyszczenia białkami komórek gospodarza (HCP), obecne na poziomie PPM w bioterapiach, stanowią poważne ryzyko immunogenności, ponieważ mogą wywoływać nieprzewidywalną odpowiedź immunologiczną u pacjentów. Ich złożony i zróżnicowany charakter sprawia, że ich wykrycie lub monitorowanie jest trudne. Podczas gdy większość zanieczyszczeń HCP jest skutecznie usuwana w typowych procesach oczyszczania, niewielka populacja HCP stanowi szczególne wyzwanie. Opracowano nokauty trudnego do usunięcia HCP CHO, lipazy lipoproteinowej, w celu poprawy stabilności polisorbatu w preparatach przeciwciał monoklonalnych.

Monitorowanie dodatków produkcyjnych

Podczas opracowywania i produkcji mAb należy monitorować szeroką gamę dodatków produkcyjnych, w tym Detergenty, białko A, Odczynniki do transfekcji, antybiotyki, środki przeciwpieniące i czynniki wzrostu.

Testy mikrobiologiczne mAbs

Różne procedury testowania mikrobiologicznego są niezbędne do rozwoju i produkcji farmaceutycznej zgodnej z GMP. Wiele mAbs jest produkowanych w mikroorganizmach, aby skorzystać z ich szybkiego tempa wzrostu i wysokiej wydajności, co sprawia, że monitorowanie i kontrolowanie obecności zanieczyszczeń mikrobiologicznych ma kluczowe znaczenie. Składnik ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, zwany endotoksyną, wywołuje reakcje od gorączki i dreszczy po śmiertelny wstrząs septyczny, co sprawia, że wykrywanie pirogenów (testy MAT in vitro)  a następnie usuwanie ich z mAb ma kluczowe znaczenie i jest wymogiem regulacyjnym. Testowanie obciążenia biologicznego powinno być stosowane w całym procesie produkcji mAb w celu monitorowania obecności potencjalnie szkodliwych zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Testowanie stabilności ma również kluczowe znaczenie dla potwierdzenia integralności produkcji mAb.

Powiązane seminaria internetowe