Electroforesis en gel
La electroforesis en gel de proteínas es una técnica habitual de separación de proteínas para su purificación, caracterización y análisis de expresión. En este enfoque, las moléculas de proteína cargadas son transportadas a través de un gel por un campo eléctrico. Su movilidad a través del campo eléctrico depende del tamaño, la forma y la carga de la proteína.
En la electroforesis de proteínas pueden utilizarse matrices de poliacrilamida y de agarosa. Esas matrices actúan como un tamiz permitiendo que las proteínas de menor tamaño se desplacen con más rapidez que las proteínas más grandes. La agarosa tiene un tamaño de poro grande y puede utilizarse para separar proteínas con un radio superior a 5-10 nm, como los complejos proteicos grandes. La poliacrilamida tiene un tamaño de poro menor, puede separar proteínas cuyo tamaño oscila entre 5 kDa y 2 000 kDa, y es la utilizada más a menudo en la electroforesis de proteínas.
Existen diversos métodos de electroforesis en gel de proteínas, cada uno de los cuales proporciona información clara de las proteínas de interés.
Artículos técnicos relacionados
- Bis-Tris gels and buffers for superior protein resolution compared to traditional tris-glycine gels.
- DNA / Protein Electrophoresis and Troubleshooting Tables
- The possible causes and potential remedies for challenges encountered during preparation of samples for SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) and optimizing electrophoresis conditions.
- The Auto2D® 2-D Electrophoresis Device fully automates difficult 2D electrophoresis methods in a quick, easy, and reproducible way. Locate difficult-to-find proteins using the Auto2D® system in less than two hours with high reproducibility.
- Biological buffers are organic substances that maintain a constant pH over a given range by neutralizing the effects of hydrogen ions.
- Ver todo (18)
Protocolos relacionados
- Introduction to PAGE. Learn about SDS-PAGE background and protocol for the separation of proteins based on size in a poly-acrylamide gel.
- TAE and TBE are both used as running buffers for nucleic acid electrophoresis but have some important differences. Review our recipes and video to give your application the best chance of success.
- An introduction to both Northern and Southern blotting, popular methods for the transfer of macromolecules to membranous support. This article also offers a Southern blot protocol and a northern blot protocol.
- Brilliant Blue G-Colloidal Concentrate has been designed for post-electrophoresis staining of proteins in IEF, PAGE, and SDS-PAGE gels. Fixing the proteins prior to staining is recommended for maximum sensitivity.
- This protocol shows how to insert gels into Ettan™ DALT electrophoresis units.
- Ver todo (33)
SDS-PAGE
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato sódico (SDS) permite la separación de proteínas en función de su masa molecular. En este método, se incorpora el detergente SDS en un tampón de migración. El SDS imparte una carga negativa neta a las proteínas, enmascarando su carga intrínseca. A medida que las proteínas se separan en presencia de SDS y de reactivos desnaturalizantes, se vuelven menos globulares y más lineales. Como consecuencia, la velocidad a la que migran las proteínas unidas al SDS a través del gel depende principalmente de su tamaño, permitiendo estimar el peso molecular al compararlo con patrones proteicos.
PAGE nativa
En la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa, las proteínas se separan de una manera que preserva su conformación nativa (estructura terciaria), las interacciones entre las subunidades (estructura cuaternaria e interacciones proteína-proteínas) y la actividad biológica. En este método, las proteínas se preparan y se hacen correr bajo condiciones no reductoras y no desnaturalizantes. La motilidad de las proteínas se determina por una combinación compleja de factores: que cada proteína puede migrar hacia cualquiera de los electrodos dependiendo de su carga y a una velocidad que depende de su forma y su comportamiento de adsorción. Por esta razón, no se recomienda la PAGE nativa para la determinación del peso molecular. La PAGE nativa se utiliza normalmente en aplicaciones que requieren purificación de proteínas activas o detección por medio de un anticuerpo que reconoce sólo la forma nativa de la proteína.
Enfoque isoeléctrico (IEF)
En el enfoque isoeléctrico se utiliza un campo eléctrico y un gradiente de pH para separar las proteínas por su punto isoeléctrico (pI) nativo. Conforme las proteínas se desplazan por el gradiente de pH, se modifica su carga neta. En un campo eléctrico, cada proteína migra al pH en el cual su carga neta sea cero (lo que se conoce como punto isoeléctrico de la proteína). Durante el proceso de separación, las proteínas de la muestra se acumulan, o «enfocan», en zonas específicas y predecibles del gel. El enfoque isoeléctrico se utiliza en la identificación de las proteínas de muestras complejas (lisados celulares y tisulares, plasma), el análisis de las modificaciones postraduccionales y la separación de las muestras para análisis mediante espectrometría de masas.
PAGE 2D
La electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional permite la resolución de las proteínas en función de su punto isoeléctrico intrínseco (pI) y de su masa. La separación por pI se produce a través del enfoque isoeléctrico (IEF). La separación por masa ocurre mediante SDS-PAGE. La PAGE 2-D proporciona la mayor resolución para el análisis de proteínas, y se utiliza habitualmente en la investigación en proteómica para resolver de cientos a miles de proteínas en un único gel.
Para seguir leyendo, inicie sesión o cree una cuenta.
¿No tiene una cuenta?