Amicon^® Ultra 원심분리 필터를 이용하는 MALDI 질량 분석법을 위한 혈청 펩타이드의 정제

바이오마커는 신약 발굴 및 개발에서 필수적입니다. 그리고 유전자 감수성, 질병 진행, 약물 반응에 대한 강력한 단서를 제공합니다. 혈청은 추정 단백질 바이오마커의 주요 공급원입니다. 신규 바이오마커 발견의 주요한 장애물 중 하나는 혈장이나 혈청 내 소금, 단백질, 지질의 존재이며, 이들의 존재는 질량 분석법에 의한 펩타이드 분석을 방해합니다. 여러 프로토콜이 조직과 체액에서 펩타이드를 추출 및 강화하기 위해 사용될 수 있습니다.

• 단백질 침전 후, C18 레진 상에서 역상 크로마토그래피에 의한 분획
• 더 작은 단백질과 펩타이드의 용해도를 강화하는 동시에 큰 단백질의 아세토나이트릴 침전
• 바이오마커 분석^1–4을 위해 저분자량 분획 준비를 위한 Ultrafiltration

C18 레진 상에서 고체상 추출법(SPE)과 조합한 한외여과는 혈청 펩타이드 정제를 위한 편리하고 효율적인 방법입니다. 이 접근법은 아세토나이트릴 침전법과 비교할 때 질량 분석법을 위한 펩타이드를 더 많이 제공합니다. 그 외에도, 원래는 머크의 Microcon^® 원심분리 필터⁵를 위해 개발되었던 필터 보조 검체 준비(FASP)는 최근 Amicon^® Ultra 원심분리 필터⁶ 사용을 위해 최적화되었습니다.

FASP의 한 가지 장점은 시료의 버퍼 교환이 가능하고 건조/침전의 우려 없이 여러 번의 회전을 통해 시료를 농축할 수 있다는 것입니다. 더욱이, FASP는 당사의 MultiScreen^® 필터 플레이트⁷를 사용하는 96웰 플레이트 형식에 적합합니다. 96웰 형식에 적합하기 때문에 생물제제를 빠르게 가공할 수 있었으며 미래에 FASP 공정을 자동화할 가능성을 열었습니다.

방법

I. 혈청 펩타이드 준비

1. 혈청, 혈장 또는 세포 용해물 1~4mL를 10% 아세토나이트릴 또는 10~20mM tris HCL 버퍼 pH 7.5와 1:1로 희석합니다.
2. 시료를 Amicon^® Ultra-4 10K NMWL 원심분리 장치에 넣고, 3000xg에서 15~30분 동안 스윙 버킷 로터로 원심분리합니다.
3. 여과액을 채취합니다.
4. 시료에 아세토나이트릴이 포함되어 있는 경우 시약을 증발시키기 위해 시료를 진공 농축기에 넣고, 그런 경우가 아니라면 바로 5단계를 계속 진행합니다.
5. 5μL의 1% TFA를 사용하여 10μL의 여과액 시료를 산성화합니다.
6. ZipTip^® μC18 피펫 팁 프로토콜을 따라 농축물을 탈염하고 시료를 세척합니다.
7. 2μL의 ∂-cyano-4-hydroxycinnamic acid 매트릭스(50% 아세토나이트릴, 0.1% TFA 내 농도 5mg/mL)를 이용하여 MALDI 대상에 시료를 직접 용리합니다. 참고: 여과에 앞서 아세토나이트릴이 혈청에 추가된 경우, ZipTip^® 정제를 하기 전에 시료를 Speed Vac^® 원심분리기에서 짧게 원심분리하여 용매를 제거합니다.

II. Amicon^® Ultra 4mL 10kDa 원심분리 필터의 여과액을 이용하는 질량 분석법에 의한 펩타이드 분석

1. 세포 용해물 또는 인간 혈청에서 획득한 펩타이드를 함유하는 한외여과물을 1% TFA로 산성화하고, 사용자 안내서에 설명된 절차에 따라 ZipTip^® μC18 또는 ZipTip^® Strong Cation Exchange 피펫 팁으로 농축합니다.
2. 시료를 1μL의 ∂-cyano-4-hydroxycinnamic acid 매트릭스(50% 아세토나이트릴, 0.1% TFA 내 농도 5mg/mL)로 덮고 MALDI 질량 분광계로 분석합니다.

III. 아세토나이트릴 침전에 의한 혈청 펩타이드 준비(대조 시료)

1. 혈청 시료에 10% 아세토나이트릴을 1:1 비율(부피:부피)로 추가하여 이전의 프로토콜 I.1)에서 명시한 대로 희석합니다.
2. 시료를 15mL 원심분리용 튜브에 넣고 시료를 원심분리하여 단백질을 침전시킵니다.
3. 상청액을 채취하고 시료를 Speed-vac 원심분리기에 넣어 아세토나이트릴을 증발시킵니다.
4. 시료를 0.1% TFA에서 재부유시키고 탈염하여 ZipTip^® μC18 피펫 팁으로 농축합니다.
5. 2μL의 ∂-cyano-4-hydroxycinnamic acid 매트릭스(50% 아세토나이트릴, 0.1% TFA 내 농도 5mg/mL)로 MALDI 대상에 직접 동시 용리를 수행합니다.

결과

Amicon^® Ultra-4 30K NMWL 원심분리 장치는 고해상도 질량 분석법을 위한 혈청 펩타이드를 준비하기 위해 사용될 수 있습니다. 공정을 거치지 않은 래트 혈청과 비교할 때, 아세토나이트릴 침전을 이용한 큰 단백질 제거 후에 데이터 품질이 개선됩니다(그림 1A, B, 아래). MALDI-TOF 검출 펩타이드 피크의 수와 품질은 한외여과된 혈청을 사용하여 상당히 개선되었습니다(그림 1B, 아래).

시료 준비 프로토콜에 역상 크로마토그래피를 단독으로 결합하거나 아세토나이트릴 침전 및 초원심분리와 함께 결합함으로써 데이터 품질은 더욱 개선되었습니다(그림 2, 아래). 여기서 ZipTip^® μC18 피펫 팁은 질량 분석법 전에 마이크로 규모의 시료 준비를 위한 편리하고 효율적인 도구의 역할을 수행했습니다. 세 가지 방법 모두를 사용하여 준비된 시료를 이용해 가장 높은 신호, 신호대잡음비, 검출된 펩타이드 수를 획득하였습니다(그림 2D, 아래).

이 접근법은 MS/MS에 의한 펩타이드 식별을 위해 ZipTip^® μC18 피펫 팁과 조합하여 직접 사용될 수 있으며, 또는 SELDI-TOF 방법을 이용하는 추가적인 표면 매개 강화 전에 첫 단계로서 사용될 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 약물 및 대사체와 같은 다른 저분자량 마커에도 적용할 수 있습니다.