TurboMix^® Bis-Tris Gel Casting Kit를 사용한 PAGE 및 SDS-PAGE용 핸드캐스팅 겔

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• 검체 준비 및 겔 러닝
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Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE)은 전기영동 이동성에 따른 단백질과 기타 거대분자를 분리하는 데 널리 사용되는 기본적인 기술입니다. 폴리아크릴아미드 겔은 아크릴아미드 단량체와 비스-아크릴아미드 가교분자의 중합을 통해 형성됩니다. 따라서 아크릴아미드와 비스-아크릴아미드는 모두 단백질이 이동할 수 있는 기공을 형성합니다.

폴리아크릴아미드 겔은 스태킹 부분과 분리 부분의 두 부분으로 구성됩니다. 겔의 스태킹 부분은 분리 겔에 들어가기 전에 검체를 단일 밴드로 농축하는 역할을 하는 아크릴아미드의 비율이 낮은 부분입니다. 아크릴아미드의 비율이 더 높은 분리 겔은 크기에 따라 단백질을 분리합니다. 아크릴아미드 농도는 기공의 크기와 선형적으로 관련이 있으며, 아크릴아미드의 농도가 높을수록 겔 내의 기공이 작아집니다. 저기공은 저분자량 단백질을 분리하는 데 적합합니다.

Polyacrylamide gel chemistry

PAGE에는 겔 버퍼 이온이 러닝 버퍼 이온과 다른 비연속 버퍼 시스템이 사용됩니다. 이 두 이온 간의 전기영동 이동성 차이는 단백질이 이동하는 이동 전압 구배를 형성합니다. Tris-Glycine 겔 화학은 가장 일반적으로 사용되는 PAGE 시스템으로 Tris-HCl로 구성된 겔과 Tris 염기와 Glycine으로 구성된 러닝 버퍼를 사용합니다. Tris-Glycine 겔은 탈아미노화와 알킬화와 같이 바람직하지 않은 단백질 변형을 초래할 수 있는 고알칼리성 환경에서 작동합니다. 따라서 단백질 밴드는 Tris-Glycine 겔에서 왜곡되거나 분리능을 잃을 수 있습니다.

이와는 대조적으로 Bis-Tris 겔은 겔 버퍼에서 Bis-Tris와 Hcl을 사용하고 러닝 버퍼에서는 MOPS와 MES를 사용합니다. Bis-Tris 겔은 중성 pH에서 작동하여 단백질 변형을 최소화하고 겔 러닝 시 단백질 안전성을 촉진합니다. 이것은 더 선명한 단백질 밴드 분리능과 정확도로 이어집니다. Bis-Tris 겔은 시간이 지남에 따라 가수분해되기 시작하는 Tris-Glycine 겔보다 유통기한이 더 깁니다. Bis-Tris 겔은 MOPS 또는 MES 기반의 러닝 버퍼와 결합할 수 있는 유연성을 가지고 있습니다. 두 이온 간의 이동 차이로 인해 단백질 분리 범위가 달라집니다. MES는 관심 단백질이 작을 때(<50 kDa) 사용해야 하며 MOPS는 중/대형 단백질의 분리에 사용해야 합니다.

단백질 준비 시 사용되는 샘플 버퍼의 유형을 고려하는 것도 중요합니다. Tris-Glycine 겔에서 Laemmli 버퍼는 일반적으로 음전하를 띤 SDS 이온에서 단백질을 변성하고 코팅하는 데 사용됩니다. 검체는 변성 촉진을 돕기 위해 100 °C에서 끓입니다. Laemmli 버퍼를 100 °C로 가열하면 pH가 고산성화되고, 이러한 열과 산성도의 조합은 Asp-Pro 펩타이드 결합에서 우선적으로 단백질 절단을 유발하는 것으로 나타났습니다(Rittenhouse and Marcus, 1984). 이것은 전기영동 중 명확한 단백질 분해산물로 이어집니다. 이와는 반대로 Bis-Tris 겔은 검체 준비 중 알칼리성 pH를 유지하고 단백질을 완전히 변성시키기 위해 70 °C 이상으로 가열할 필요가 없는 LDS 샘플 버퍼를 사용합니다. 이 제제는 Asp-Pro 펩타이드 결합의 절단을 최소화하여 단백질의 무결성을 유지합니다.

표 1. Tris-Glycine과 Bis-Tris 겔 화학 비교

	Tris-Glycine	Bis-Tris
Operating pH	9.5 (alkaline)	7.0 (neutral)
Sample buffer pH	5.2	8.5
Ion fronts	Tris (+) Glycine (-)	Tris (+) MOPS (-) MES (-)
Protein separation range	6 kDa – 400 kDa	6 kDa – 400 kDa
Protein stability during separation	Deamination and alkylation can occur	+++
Effect on Asp-Pro peptide bonds	Extended heating in SDS sample buffer causes cleavage	LDS sample buffer uses mild heating conditions and Asp-Pro bonds remain intact
Run time	Moderate	Fast
Shelf life	Limited	4 weeks +

그림 1. Tris-Glycine(좌)과 Bis-Tris(우) 겔 비교. Tris-Glycine과 Bis-Tris 겔을 12% 아크릴아미드로 핸드캐스팅하고 밤새 중합시킵니다. 겔에 동일한 대장균 용해물의 적정(레인 3~6)과 mPAGE^® 비염색 단백질 표준물(레인 2 & 7), mPAGE^® 염색 단백질 표준물(레인 1)을 로딩합니다. Tris-Glycine 또는 MOPS 러닝 버퍼에서 겔을 러닝하고, ReadyBlue™ 단백질 겔 염색으로 1시간 동안 염색한 후 탈이온수로 1시간 동안 탈염색합니다.

Hand casting polyacrylamide gels

아크릴아미드 구배에서 다양한 크기의 단백질 분석 등 특수한 목적을 위해 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔의 구매가 가능하지만, 많은 연구자들은 본인이 직접 폴리아크릴아미드 겔을 캐스팅하는 것을 선택합니다. 핸드캐스트 폴리아크릴아미드 겔은 프리캐스트 겔에 비해 저렴하지만, 시약과 캐스팅 장비 준비 작업은 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 겔 버퍼 제제의 차이는 일관되지 않은 겔 성능과 품질로 이어질 수 있습니다.

TurboMix^® Bis-Tris Gel Casting Kit

TurboMix^® Bis-Tris Gel Casting Kit는 사전 혼합 완충액과 아크릴아미드 용액을 공급하여 핸드캐스팅 겔의 가변성과 시간 소모적인 특성을 제거합니다. 키트에는 아크릴아미드 겔의 분리 부분을 형성하는 20% 아크릴아미드 Resolving Solution이 포함되어 있습니다. Resolving Solution은 탈이온수로 8%~15% 사이의 원하는 비율의 아크릴아미드로 희석할 수 있습니다. 키트에는 아크릴아미드 겔의 스태킹 부분을 형성하는 4% 아크릴아미드 Stacking Solution도 포함되어 있습니다. 이러한 용액들은 분리 겔과 스태킹 겔을 추가할 때 중합 대기 시간이 없는 빠른 캐스팅이 가능하도록 조제되었습니다. 데모 비디오와 간략한 프로토콜을 아래에서 확인할 수 있습니다.

데모 비디오: TurboMix^® Bis-Tris Kit를 사용하여 나만의 폴리아크릴아미드 겔 캐스팅하기

TurboMix^® QUICK CAST PROTOCOL

1. TurboMix^® Resolving Solution과 탈이온수, 10% 과황산암모늄(APS), TEMED를 깨끗한 유리 비이커 또는 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 원하는 아크릴아미드 비율로 분리 겔을 준비합니다. 표 2~4의 용량을 곱해 여러 개의 겔을 한 번에 캐스팅할 수 있습니다. 참고: 캐스팅 직전에 10% APS와 TEMED를 첨가합니다.

표 2. 겔 캐스팅을 위한 Resolving Solution과 Stacking Solution 준비. 표에 나열된 용량은 1 mm 두께의 7.4 x 8.2 cm 크기 미니 겔 1개를 캐스팅하는 데 충분하며, 해당 용량에 n(원하는 겔의 수)을 곱해 한 번에 여러 개의 겔을 캐스팅할 수 있음.

(For 1 mm thick mini-gel)
Resolving Gel		Stacking Gel
Gel percentage	8%	10%	12 %	15%	4%
TurboMix® Resolving Solution	2.4 mL	3.0 mL	3.6 mL	4.5 mL	n/a
TurboMix® Stacking Solution	n/a	n/a	n/a	n/a	2 mL
De-ionized water	3.6 mL	3.0 mL	2.4 mL	1.5 mL	n/a
10% APS	30 µL	30 µL	30 µL	30 µL	20 µL
TEMED	3 µL	3 µL	3 µL	3 µL	2 µL

표 3. 겔 캐스팅을 위한 Resolving Solution과 Stacking Solution 준비. 표에 나열된 용량은 0.75 mm 두께의 7.4 x 8.2 cm 크기 미니 겔 1개를 캐스팅하는 데 충분하며, 해당 용량에 n(원하는 겔의 수)을 곱해 한 번에 여러 개의 겔을 캐스팅할 수 있음.

(For 0.75 mm thick mini-gel)
Resolving Gel		Stacking Gel
Gel percentage	8%	10%	12 %	15%	4%
TurboMix® Resolving Solution	1.8 mL	2.25 mL	2.7 mL	3.38 mL	n/a
TurboMix® Stacking Solution	n/a	n/a	n/a	n/a	1.5 mL
De-ionized water	2.7 mL	2.25 mL	1.8 mL	1.12 mL	n/a
10% APS	22.5 µL	22.5 µL	22.5 µL	22.5 µL	15 µL
TEMED	2.25 µL	2.25 µL	2.25 µL	2.25 µL	1.5 µL

표 4. 겔 캐스팅을 위한 Resolving Solution과 Stacking Solution 준비. 표에 나열된 용량은 1.5 mm 두께의 7.4 x 8.2 cm 크기 미니 겔 1개를 캐스팅하는 데 충분하며, 해당 용량에 n(원하는 겔의 수)을 곱해 한 번에 여러 개의 겔을 캐스팅할 수 있음.

(For 1.5 mm thick mini-gel)
Resolving Gel		Stacking Gel
Gel percentage	8%	10%	12 %	15%	4%
TurboMix® Resolving Solution	3.6 mL	4.5 mL	5.4 mL	6.75 mL	n/a
TurboMix® Stacking Solution	n/a	n/a	n/a	n/a	3.0 mL
De-ionized water	5.4 mL	4.5 mL	3.6 mL	2.25 mL	n/a
10% APS	45 µL	45 µL	45 µL	45 µL	30 µL
TEMED	4.5 µL	4.5 µL	4.5 µL	4.5 µL	2 µL

2. TurboMix^® Stacking Solution을 깨끗한 별도의 유리 비이커 또는 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 스태킹 겔을 준비하고, 필요한 양의 TEMED와 10% APS를 추가합니다. 참고: 캐스팅 직전에 10% APS와 TEMED를 첨가합니다.
3. 겔 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 시약을 부드럽게 혼합합니다.
4. 혈청학적 피펫으로 각 카세트에 분리 겔을 원하는 높이로 채웁니다.
5. 혈청학적 피펫을 카세트의 중앙에 배치하고 부드럽게 스태킹 겔을 추가해 쇼트 플레이트의 상단까지 채웁니다. 피펫팅이 이루어지는 곳에 꺼짐이 발생할 수 있지만 곧 수평이 맞춰집니다.
6. 빠르고 조심스럽게 빗을 넣어 톱니 아래에 기포가 끼지 않도록 합니다.
7. 겔을 1시간 동안 중합시킵니다.
8. 겔은 즉시 사용하거나 탈이온수에 적신 종이 타월로 싼 후 밀폐 용기에 최대 4주까지 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

 

검체 준비 및 겔 러닝

1. Bis-Tris 겔은 SDS 샘플 버퍼보다 더 알칼리성인 LDS 샘플 로딩 버퍼가 필요합니다. 검체는 DTT 또는 β-머캅토에탄올을 사용하여 환원하거나 용도에 따라 비환원으로 사용할 수 있습니다. 검체를 표 5에 따라 준비합니다.
   

표 5. PAGE 검체 준비의 예. LDS 샘플 버퍼의 최종 농도는 1X. DTT의 최종 농도는 0.1 M

Reduced	Non-reduced
Sample	6.5 - X µL	7.5 - X µL
DI water	X µL	X µL
4X LDS buffer4X LDS buffer	2.5 µL	2.5 µL
1 M DTT	1 µL	N/A
Total volume	10 µL	10 µL

2. 검체를 70 °C에서 10분 동안 가열합니다(끓이지 않음).
3. 검체와 단백질 표준물을 웰에 로딩합니다.
4. 동일한 양의 1X 로딩 버퍼를 비어있는 웰에 추가합니다.
5. 염료 또는 단백질 표준물이 겔의 끝에 도달할 때까지 겔의 비율에 따라 약 30~60분간 겔을 200V에서 러닝합니다.