유도만능줄기세포 배양 프로토콜

서론

유도만능줄기세포(iPSC)는 3개의 배엽, 다시 말해 외배엽, 내배엽 및 중배엽 모두에 대응하는 분화된 자손을 생성할 수 있는 능력이 있습니다. In vitro 인간 iPSC를 확장하고 세포 유형 특이적 분화 프로토콜에 종속시키는 능력은 기본적인 줄기세포 연구 및 약물 개발 응용분야를 위한 환자 유래 "접시 속의 질병" 세포 모델 생성에 결정적입니다.

이 프로토콜 지침은 유도만능줄기세포 유럽은행(EBiSC)에 의해 공급되는 인간 iPSC를 해동, 배양, 냉동보존하는 방법에 대해 각 단계를 상세히 설명합니다. 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 세포주는 다른 그 어떤 확립 세포주와도 다릅니다. 만약 iPSC 배양에 익숙하지 않다면, 다음 지침을 주의 깊게 읽어보십시오.

성공을 위한 주요 포인트

• 시작하기 전에 필요한 시약, 해동, 계대(대이음), 사전 조치, 문제해결 방법을 포함한 이 지침들을 주의 깊게 읽어보십시오.
• 필요한 모든 시약은 세포 해동 전에 사용할 수 있도록 준비되어야 합니다.
• 올바른 배지와 매트릭스 조합을 사용하십시오. iPSC는 특화된 배지와 배양 조건이 필요합니다.
• 장비를 정기적으로 교정하고 유효기간이 지난 시약을 사용하지 않습니다.

방법

시험성적서(CoA)는 각 세포주 특이적 배지 및 매트릭스에 있는 해동 세포를 권장합니다. 필요한 경우, 사용하는 매트릭스 및 배지는 계대 기간에만 대체하여 변경할 수 있습니다. 세포는 배지나 매트릭스 교체 이후 적응하는 시간이 필요할 수도 있습니다. 권장 조직배양 시스템을 사용하지 않은 경우 세포 생존성이나 품질은 보장할 수 없습니다.

세포외 매트릭스 조제

기저막 추출물(BME)의 조제

줄기세포 적격 ECM Gel Matrix(CC131)는 용해성이 있는 기저막 추출물(BME)이며 인간 ES/iPS 세포배양을 위해 사전 검증된 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 종양으로부터 정제되었습니다. 매트릭스는 20-40°C에서 중합되어 재구성된 기저막을 형성합니다. 제품에는 라미닌, IV형 콜라겐, 기타 ECM 중에서 heparan sulfate가 포함되어 있습니다. 매트릭스는 시간 소모적인 사전스크리닝 및 로트 식별의 필요성을 없애고, 만능성 인간 ES/iPS 세포의 장기간 배양에 필요한 이상적인 ECM 코팅을 제공하며, 만능성 무혈청/무지지세포 인간 ES/iPS 세포 확장 배지(즉, mTeSR^®, PluriSTEM™)의 배양을 지원합니다. 아래에 줄기 세포 적격 ECM Gel Matrix를 이용한 6웰 플레이트의 코팅에 대한 일반적인 지침이 있습니다.  모든 절차는 생물학적안전실험대에서 무균 조건으로 수행되어야 합니다.

1. 2-8°C 냉장고에 있는 ECM Gel Matrix(CC131)를 사용 하루 전에 해동합니다. 일단 해동되면, ECM 겔을 항상 얼음 위에서 유지하며 사전 냉각된 배지 및 피펫을 사용하여 생성물의 겔화를 막습니다.
2. ECM Gel Matrix(CC131)를 DMEM/F12(D6421) 콜드 배지에 1:80으로 희석합니다.  필요한 용량에 따라 규모를 조정하십시오.  아래에 6웰 플레이트를 1:80으로 희석된 ECM 겔 1.5 mL로 코팅하는 예시가 있습니다.
   1:20 희석을 조제하려면, 15 mL 원뿔 튜브 내에서 ECM 겔 0.5 mL를 DMEM/F12 콜드 배지 또는 DMEM 배지 9.5 mL에 추가합니다.  총 부피 = 10 mL.
   최종 1:80 희석 조제를 위해 추가적인 4배 희석이 필요합니다.  2.5 mL의 1:20 희석 ECM 겔을 DMEM/F12 콜드 배지 7.5 mL에 추가합니다.  총 부피 = 10 mL
   참고: 추천하는 희석은 1:80이지만, 원하는 경우 더 농축된 줄기세포 적격 ECM 겔이 사용될 수도 있습니다.
3. 1:80 희석된 ECM Gel Matrix(CC131) 1.5 mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.  배양 플레이트를 스월링하여 ECM Gel Matrix가 플레이트 표면 전체에 고르게 퍼지도록 합니다.  2–8°C 냉장고에서 하룻밤 동안 또는 사용하기 전 냉장고에서 최소 2시간 동안 보관합니다.  즉시 사용하지 않을 경우, 파라필름으로 ECM 코팅된 배양 플레이트를 둘러싸서 사용할 준비가 될 때까지 2-8^°C에서 보관합니다. ECM 코팅된 배양 플레이트는 3-4일 내에 사용합니다.
4. 세포를 파종(seeding)하기 전, 플레이트를 실온으로 다시 가지고 와서 10-15분 동안 두었다가 코팅 용액을 제거하고 인간 ES/iPSC 성장 배지(SCM130)를 웰마다 3 mL씩 추가합니다. 이제 세포를 새로 코팅된 플레이트 위에 플레이팅할 수 있습니다.

중요:  플레이트가 건조되지 않도록 하십시오.

Vitronectin의 조제

1. Vitronectin(CC130)을 수령하면 -80°C에서 보관합니다. 사용하기 전에 실온에서 vitronectin 스톡 바이알을 해동하고 멸균 폴리프로필렌 튜브에 60 μL로 분주하여 조제합니다. 분주한 양을 -80°C에서 냉동시키거나 즉시 사용합니다. 한 번 분주한 60 μL는 6웰 플레이트의 모든 웰을 코팅하는 데 충분합니다.
2. Vitronectin을 작업 농도인 0.5 μg/cm²으로 조제하기 위해, vitronectin 60 μL를 실온의 PBS(D8537) 6 mL와 천천히 혼합하여 vitronectin을 1:100으로 희석합니다. 희석된 vitronectin을 1 mL씩 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
3. 코팅된 배양 용기를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 보관이 필요한 경우, 용기를 Parafilm^®(P7793)으로 밀봉하여 2-8°C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다. 용기를 사용하기 전에 1시간 동안 실온과 같아지도록 합니다.
4. 배양 용기 준비를 위해 배양 용기에서 과량의 vitronectin을 제거해서 버립니다. Vitronectin 제거 후 배양 용기를 씻어낼 필요는 없습니다.

세포 배양 배지 조제

mTeSR™-1 배지

1. 필요한 경우, mTeSR™1 보충제(5x)를 냉동기에서 꺼내어 사용하기 전에 2-8°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. 37°C에서 해동하지 마십시오.
2. mTeSR™1 보충제(5x) 100 mL를 무균적으로 콜드(2-8°C) 기저배지 400 mL에 추가합니다.
3. 배지를 배양 작업 1주일 동안 필요한 용량으로 분주합니다.
4. 완성된 mTeSR™1은 2-8°C에서 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 냉동된 완성 mTeSR™1은 한 번 해동할 수 있습니다. 해동한 배지를 반복적으로 냉동시키지 마십시오. 사용하기 전, mTeSR™1을 실온까지 데웁니다. 배지를 하루에 2시간 이상 실온에 방치하면 안 되며, 빛 노출을 피하여 배지 구성성분의 분해를 방지합니다.

Essential 8™(TeSR™-E8) 배지

1. 필요한 경우, E8 보충제(50x)를 냉동기에서 꺼내어 사용하기 전에 2-8°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. 37°C에서 해동하지 마십시오.
2. 무균적으로 E8 기저배지 10 mL를 제거하여 490 mL가 남게 합니다.
3. E8 보충제(50x) 10 mL를 무균적으로 콜드(2-8°C) 기저배지 490 mL에 추가합니다.
4. 배지를 배양 작업 1주일 동안 필요한 용량으로 분주합니다.
5. 완성된 E8은 2-8°C에서 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 냉동된 완성 E8은 한 번 해동할 수 있습니다. 해동한 배지를 반복적으로 냉동시키지 마십시오. 사용하기 전, E8을 실온까지 데웁니다. 배지를 하루에 2시간 이상 실온에 방치하면 안 되며, 빛 노출을 피하여 배지 구성성분의 분해를 방지합니다.

PluriSTEM^® 인간 ES/iPSC 배지

PluriSTEM^® 배지(SCM130, SCM132)는 무혈청 배지 기반의 완전한 소분자이며, 인간 ES/iPS 세포의 무지지세포 배양을 가능하게 하고, 형태 또는 장기간 기능을 손상시키지 않으면서도 배지를 이틀에 한 번 교체할 수 있게 합니다. 이 배지는 완전하므로 별도의 보충이 필요하지 않습니다. 필요한 경우, 배지를 냉동기에서 꺼내어 사용하기 전에 2-8°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. 37°C에서 해동하지 마십시오. 일단 해동하고 나면, PluriSTEM^® 배지는 2-8°C에서 보관하고 2주 이내에 사용해야 합니다.

 

인간 iPSC의 해동

1. 세포는 냉동 바이알을 37°C 유지 항온 수조에 넣어 신속하게 해동되어야 합니다. 항온 수조 내에서 냉동 바이알을 천천히 스월링하며 신속하면서도 냉동 바이알 캡은 물에 잠기지 않게 합니다. 개봉 전, 70% 에탄올(793213) 또는 동등한 소독제로 냉동 바이알을 소독합니다.
2. 5 mL 멸균 피펫을 사용하여 동결보호제/세포를 냉동 바이알에서 15 mL 원심분리용 튜브로 옮깁니다. 세포를 물리적으로 손상시키지 않도록 주의합니다.
3. 적합한 배지 10 ml를 실온에서 천천히 한 방울씩 세포가 들어있는 15 mL 원심분리용 튜브에 추가합니다. 15 mL 원심분리용 튜브를 앞뒤로 천천히 흔들면서 배지를 한 방울씩 추가합니다. 이것은 세포에 삼투압 충격을 최소화하고 세포를 가능한 한 부드럽게 다룰 수 있게 도와주는 결정적인 단계입니다.
4. 튜브를 확인하여 모든 세포 구성성분이 확실히 제거되었는지 점검합니다. 필요하다면, 적합한 배지 1 mL로 씻어냅니다.
5. 적은 양의 세포가 세포 계수를 수행하는 데 사용될 수 있습니다. 단일 세포 부유액은 트립신이나 다른 적절한 세포 탈착 배지를 이용하여 만들어집니다. 일반적인 지침으로는 6웰 플레이트의 웰 하나에서 파종 밀도 범위가 2x10⁵-1x10⁶  사이인 바이알 세포입니다. 모든 구체적인 EBiSC 세포주 로트 번호에 대한 지침은 시험성적서를 참조하십시오.
6. 200 x g에서 2분 동안 세포를 원심분리합니다. 상청액은 제거하여 폐기합니다.
7. 적절한 양(예를 들어 6웰 플레이트에서 웰 하나당 1.5–2 mL)의 배지를 추가하여 배양 용기를 준비합니다.
8. 15 mL 원심분리용 튜브를 약하게 두드려서 세포 펠릿이 풀어지게 한 뒤, 적합한 배지를 조심스럽게 1 mL 추가하고, 코팅된 6웰 플레이트 중 2개의 웰에 파종합니다(다른 배양 형식을 사용하거나 시험성적서에서 다르게 권장하는 경우에는 조정하십시오). 세포를 과도하게 흡인하지 마십시오. 그렇게 하면 단일 세포 부유액의 생성 때문에 생존성 감소로 이어질 것입니다.
9. 플레이트를 좌우 그리고 앞뒤로 천천히 흔들면서 웰 전체에 걸쳐 균일하게 세포를 퍼뜨립니다.
10. 해동 후 즉시, 48시간 뒤, 약 70-80% 밀집도에서 세포 이미지를 기록하는 것이 권장됩니다.

 

인간 iPSC의 배양

1. iPSC 유사 형태, 분화세포의 존재 여부 및 밀집도를 확인하기 위해 iPSC 세포주를 위상차 현미경(4x, 10x, 20x, 40x 확대) 하에서 매일 관찰하는 것은 좋은 방법입니다. 일반적인 스코어링에 대한 개요가 아래 제시되어 있습니다.

등급	설명
A	명확한 가장자리를 가진 최적의 조밀한 iPSC 콜로니; 콜로니 전체에 걸쳐 균일한 형태
B	가장자리 주변에 일부 분화를 보이는 허용 가능한 iPSC 콜로니, 세포들은 콜로니 내에 더 느슨하게 들어 차 있음
C	작은 iPSC 콜로니들이 나타나며 좋은 부착성을 보임
D	부착성이 나쁘고 뚜렷한 iPSC가 없음

그림 1. iPSC 콜로니의 스코어링

그림 2. iPSC 배양 내 분화 정도

2. 흡인기 피펫을 사용하여 웰에서 배지의 약 95%를 제거하여 세포에 새 배지를 추가합니다. 배지를 완전히 제거하지는 마십시오. 세포가 건조되지 않도록 얇은 배지막이 세포층을 덮어야 합니다.
3. 6웰 플레이트의 웰 하나당 새로운 배지 2 mL를 무균적으로 웰 측면을 향해 서서히 추가합니다. 세포를 37°C/5% CO₂에서 배양합니다.
4. 일반적으로 배지 교환은 7일 중 6일 동안 매일 배지의 양을 증가시키면서(정상 양의 1.5x-2x; 세포 밀도에 따라 달라짐) 행해지고, 세포가 배지 교환 사이 기간에 더 오래 머물러야 하는 경우에 이렇게 합니다. 배지 교환 사이의 기간은 2일을 초과하지 않도록 합니다.

인간 iPSC의 계대

EZ-LiFT™ 시약 계대 프로토콜

1. 시작하기 전에 EZ-LiFT™ 시약(SCM139)을 37°C까지 데웁니다.
2. 배양 배지를 흡인하고 웰을 EZ-LiFT™ 시약(SCM139) 1.5 mL로 세척합니다.
3. EZ-LiFT™ 시약(SCM139) 1 mL를 각 웰에 추가합니다.  플레이트를 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 
4. 4분 뒤에 플레이트 바닥을 빠르게 두드립니다(즉, 5초 동안 20-25회 두드림). 
5. 플레이트를 37°C 배양기에 추가 4분 동안 다시 넣어 놓습니다.
6. 4분 뒤에 플레이트 바닥을 빠르게 두드립니다(즉, 5초 동안 20-25회 두드림).
7. 현미경으로 웰 검사를 빠르게 수행합니다.
   1. 상당수의 분리된 덩어리가 보일 경우 8단계로 진행합니다.
   2. 명확한 분리가 관찰되지 않는다면 4-7단계를 반복하되
   5단계에서 37°C 배양은 4분이 아닌 2분 동안 수행되어야 합니다.  8단계로 진행합니다.
8. 세포 부유액을 조심스럽게 수집하여(약 1 mL) 15 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.  배양 배지 5 mL를 천천히 세포 부유액에 추가하여 중화시킵니다.  피펫을 위아래로 움직이며 사용하지 않습니다. 이는 세포 덩어리를 부숴서 단일 세포 부유액으로 만들 수도 있습니다.
9. 800 rpm에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다.
10. PluriSTEM^®(SCM130)처럼 만능성을 지원하는 배지 1 mL에 세포를 부드럽게 재현탁합니다.  피펫을 두 번 이상 위아래로 움직이지 마십시오.  과도한 피펫팅에 의해 단일 세포로 풀어질 수 있습니다. 
11. 분리된 세포 덩어리를 새로 코팅된 6웰 플레이트에 계대시킵니다. 분할 비율은 1:6과 1:30 사이로 합니다. 매일 세포를 모니터링합니다. 세포는 일반적으로 6-8일이면 60-80%의 밀집도에 도달할 것이며, 분할 비율에 따라 달라집니다.

Accutase 계대 프로토콜

1. 충분한 양의 PluriSTEM^®(SCM130), Accutase(A6964), DMEM/F12(D6421)를 분주하여 세포를 계대시킵니다. 시약을 실온까지 데웁니다.
2. 세포를 계대시키기 1시간 전에, ROCK 억제제(ROCKi), Y-27632(SCM075)를 6웰 플레이트의 각 웰에 최종 농도 10 μM으로 추가합니다.
3. 1시간 뒤, 해부현미경을 이용하여 계대시킬 인간 만능성 세포를 담고 있는 플레이트를 시각적으로 검사합니다. 자발적 분화 영역을 제거합니다.
4. 웰에서 긁어낸 영역의 세포를 포함하는 배지를 흡인합니다. 웰마다 DMEM/F-12(D6421) 배지 또는 1X PBS(D8537) 2 mL로 세척합니다.
5. 6웰 플레이트의 각 웰에 Accutase(A6964) 1 mL로 흡인 및 교체합니다. 37°C에서 8-10분 동안 배양합니다.
6. 사용한 Accutase 1 mL당 PluriSTEM^® 배지(SCM130) 1 mL를 추가하여 Accutase 반응을 중지시킵니다. 멸균 1000 μL 피펫 팁으로 세포를 부드럽게 떼어냅니다.
7. 분리된 세포를 15 mL 원뿔 튜브에 수집합니다. 웰을 추가적인 PluriSTEM^® 배지(SCM130) 2 mL로 세척하여 모든 잔존 세포를 수집합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세척을 추가합니다.
8. 세포 부유액을 담은 15 mL 원뿔 튜브를 300 x g에서 5분 동안 실온에서 원심분리합니다.
9. 상청액을 흡인합니다. 10 μM ROCK 억제제인 Y-27632(SCM075)를 포함한 신선한 PluriSTEM^® 배지(SCM130)에 세포를 재현탁합니다.
10. Scepter™ 계수기나 혈구계를 사용하여 세포의 수를 셉니다. 세포가 단일 세포 부유액 상태인지 확인합니다. Trypan Blue(T8154) 배제법으로 세포 생존성을 확인합니다.
11. 범위가 0.5–1x10⁴ cells/cm²인 다양한 세포 밀도의 적정을 설정합니다. 이는 10 μM ROCK 억제제를 포함한 PluriSTEM^® 배지에서 Matrigel 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰당 들어있는 50,000–100,000개의 세포에 해당합니다.
12. 다음 날, 신선한 PluriSTEM^® 배지(SCM130)로 교체합니다. 이틀에 한 번씩 신선한 PluriSTEM^® 배지(SCM130)로 교체합니다(각 웰당 3 mL 용량). 세포는 5-7일 마다 계대될 수 있습니다.

Dispase 계대 프로토콜

1. 충분한 양의 Dispase II, 1 mg/mL(CC130) 및 DMEM/F12(D6421)를 분주하여 세포를 계대시킵니다. 시약을 실온까지 데웁니다.
2. 해부현미경을 이용하여 계대시킬 인간 만능성 세포를 담고 있는 플레이트를 시각적으로 검사합니다. 자발적 분화를 한 영역이 있는지 콜로니를 조사합니다.
3. p200 pipetman에 부착된 멸균 p200 피펫 팁을 사용하여 자발적 분화 영역을 긁어냅니다.
4. 웰에서 긁어낸 영역의 세포를 포함하는 배지를 흡인합니다. 웰마다 DMEM/F-12(D6421) 배지 또는 1X PBS(D8537) 2 mL로 세척합니다.
5. 계대시킬 만능성 인간 ES 또는 iPS 세포가 담겨 있는 6웰 플레이트의 각 웰당 Dispase II, 1 mg/mL(CC130) 1 mL를 추가합니다.
6. 37°C에서 6-7분 동안 배양합니다. 배양 후, 현미경 하에서 콜로니를 검사합니다. 콜로니 가장자리는 플레이트 표면에서 약간 둥글게 위로 그리고/또는 접혀서 보일 수도 있지만, 콜로니의 대부분은 플레이트에 여전히 붙어있어야 합니다.
7. Dispase II(CC130)를 흡인하고 각 웰을 1X PBS(D8537) 또는 DMEM/F12(D6421) 배지 2 mL로 부드럽게 2회 세척합니다.
8. 각 웰에 PluriSTEM^® 배지(SCM130) 1.5–2 mL를 추가합니다. 세포 스크레이퍼로 콜로니를 살살 떼어냅니다.
9. 5 mL 혈청 피펫으로 세포 덩어리를 15 mL 원뿔 튜브에 수집합니다. 피펫의 위아래 동작을 최소로 하십시오. 콜로니를 최적 이하의 작은 조각으로 부술 수도 있습니다.
10. 웰을 추가적인 PluriSTEM^® 배지(SCM130) 2 mL로 세척하여 모든 잔존 세포 덩어리를 수집합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세척을 추가합니다.
11. 세포 덩어리를 담은 15 mL 원뿔 튜브를 300 x g에서 5분 동안 실온에서 원심분리합니다.
12. 상청액을 흡인합니다. 계대를 위해 세포 덩어리를 적절한 용량의 PluriSTEM^® 배지(SCM130)로 재현탁합니다. 세포를 1:3에서 1:6으로 분할하며, 비율은 세포 덩어리 숫자에 따라 달라집니다.
13. 플레이트를 37°C 배양기에 넣습니다. 플레이트를 좌우 그리고 앞뒤로 천천히 흔들면서 교반하여 웰 표면 전체에 걸쳐 균일하게 세포 덩어리를 퍼뜨립니다.
14. 다음 날, 각 웰당 신선한 PluriSTEM^® 배지(SCM130) 3 mL로 교체합니다. 세포는 5-7일 마다 계대될 수 있습니다.

인간 iPSC의 냉동보존

1. 냉동보존 절차 동안 시약 및 냉동 용기(예: Mr. Frosty)를 차갑게 유지합니다.
2. 세포는 해동 후 생존률을 높이기 위해 성장의 로그 단계에 있을 때 냉동보존되어야 합니다. 수확을 위한 이상적인 시기는 일반적으로 세포 밀집도가 약 70-80%일 때입니다.
3. 동결보존 배지의 유형은 배양 조건 및 실험실의 선호도에 따라 달라집니다. 시판되는 Cryostor^® CS10(C2874)이나 냉동 혼합물(10% DMSO를 포함한 FBS 및 배양 배지)에 기반한 DMSO(D2650)를 사용합니다. Cryostor^® 배지는 즉시 사용 가능한 형태로 제공되며 2-8°C에서 보관합니다. 동결보존 기반 DMSO 조제를 위해 40% FBS를 10% DMSO와 혼합한 뒤 50% 적합한 배지와 혼합합니다.
4. 사용한 배지를 조직배양 용기에서 제거하고, 세척 버퍼를 권장량만큼 사용하여 용기를 2회 세척합니다. 세척 버퍼는 배양 조건에 따라 달라집니다(Cultrex/Matrigel용 세척 버퍼는 0.5 mM EDTA, Vitronectin용 세척 버퍼는 PBS).
5. 조직배양 플라스틱에서 세포를 분리하기 위해, 0.5 mM EDTA(03690) 1 mL를 추가합니다. 세포를 권장 시간 및 온도에서 배양하며, 사용된 매트릭스에 따라 배양 조건은 달라집니다. 웰에서 EDTA를 흡인합니다. 콜로니는 플라스틱에 매우 느슨하게 붙어 있으므로 주의를 기울여야 합니다.
6. 각 웰에 동결보호제 1 mL를 추가합니다. 1 mL 멸균 피펫으로 용기 전체적으로 동결보호제를 부드럽게 씻어서 플라스틱으로부터 세포가 떨어지게 합니다. 3회 이상 흡인하지 마십시오. 세포 덩어리가 단일 세포로 분리되지 않게 합니다. 동결보호제와 세포를 라벨을 붙인 냉동 바이알에 넣고 혼합합니다.
7. 만약 더 많은 웰의 냉동보존을 원하면, 같은 계대수 및 배양 조건인 세포들을 모아야 합니다. 모인 세포들을 분주하여 세포 계수에 사용할 수 있습니다. 수확된 세포를 200 x g에서 2분 동안 원심분리하고, 사용한 배지를 흡인하여 적절한 용량의 동결보호제에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 6웰 플레이트에서 웰 1개는 약 1-2 x 10⁶개의 세포를 만들어 냅니다. 냉동 바이알 1개당 약 1-2 x 10⁶개의 세포를 냉동하는 것이 권장됩니다. 냉동 바이알당 동결보호제-세포 혼합물 1 mL를 사용합니다.
8. 냉동 바이알을 미리 냉각시킨(2-8°C) Mr. Frosty 용기에 즉시 넣고, Mr. Frosty 용기를 -80°C 냉동고에 곧바로 옮깁니다. 세포를 -80°C에서 하룻밤 동안(16-36시간) 유지합니다. 일단 냉동되면, 세포를 드라이아이스 상에서 초저온 저장 용기로 옮깁니다(액체질소 또는 -150°C 냉동고).

인간 iPSC의 특성화

iPSC의 미분화 상태는 알칼리인산분해효소(alkaline phosphatase)(SCR004) 및 줄기세포 전사 인자인 나노그, Oct-4 및 Sox-2의 높은 수준의 발현을 특징으로 합니다. 이러한 세포들은 또한 단계 특이적 배아 항원(SSEA1, 3, 4) 및 podocalyxin(TRA-1-60, TRA-1-81) 마커의 발현과 관련하여 해당 세포들의 마우스 대응체와는 뚜렷한 차이점을 보입니다. 세포는 줄기세포 특성화 키트(SCR001, SCR002, SCR078)를 사용한 항체 ICC 염색 또는 PCR 분석을 이용하여 분석할 수 있습니다.

표 1. 인간 iPSC 마커의 요약

세포 유형	알칼리인산분해효소(Alkaline Phosphatase)	Oct-4	Sox-2	나노그	SSEA-1	SSEA-4	TRA-1-60	TRA-1-81
인간 iPSC	+	+	+	+	-	+	+	+
마우스 iPSC	+	+	+	+	+	-	-	-

그림 3. 만능성 iPS 세포는 만능성 마커를 발현합니다. 알칼리인산분해효소 (40x) (A), Oct-4 Alexa 488 (MAB4401A4, 400x) (B), Sox-2 Cy3 (MAB4423C3, 100x) (C), 나노그 Alexa 488 (MABD24A4, 400x) (D), TRA-1-60 Cy3 (MAB4360C3, 100x) (E), TRA-1-81-Cy3 (MAB4381C3, 100x) (F). 핵은 DAPI (blue) (D9542)로 대조염색되었습니다.

 

문제해결 방법

문제	관찰	해결책
해동 후 iPSC의 낮은 생존성	• 회수 이후 4일 이내에 콜로니가 거의 없거나 아예 없음	• 냉동 바이알이 신속하게 해동되었는지 그리고 배지가 세포에 아주 천천히 추가되었는지(튜브를 천천히 스월링하면서 점적식으로) 확인합니다. • 해동할 때 10 μm ROCK 억제제를 추가합니다. 하지만 일상적으로는 사용하지 않습니다. • 세포가 성장의 로그 단계 및 낮은 수준의 분화도에서 저장되었는지 확인합니다. • 작은 콜로니가 튼튼하게 성장하도록 두고 낮은 분할 비율로 계대시킵니다(1:1 또는 1:2).
계대 이후 낮은 생존성	• 세포가 적절하게 부착되지 않음 • 비정형적인 형태 • 높은 세포 사망률 • 세포가 증식하지 않음	• 낮은 분할 비율을 사용하고 더 밀집도가 높은 배양을 유지합니다. • 세포가 계대할 때 성장의 로그 단계에 있는지 확인합니다. • 신속하게 작업하거나 EDTA 배양 시간을 감소시킵니다. 세포 덩어리 크기는 EDTA에 너무 오래 노출되면 영향을 받을 수 있기 때문입니다. • 만약 세포가 쉽게 떨어져 나오지 않으면 EDTA 배양 시간을 증가시킵니다. 이것은 세포를 너무 거칠게 세척하면 지나치게 작은 덩어리 또는 단일 세포 부유액이 만들어지므로 이를 피하기 위해서입니다. • 플레이트가 올바로 코팅되었는지, 매트릭스가 유효기간을 지나지 않았는지 확인합니다. 그리고 이 문제가 정기적으로 발생하는데도 다른 이유가 없다면 제조업체와 함께 배치를 확인합니다.
자발적 분화	• 콜로니의 가장자리가 명확하지 않음 • 콜로니 내 세포가 덜 조밀함 • 세포가 납작하고 크게 또는 섬유모세포처럼 보임	• 세포가 권장사항대로 배양되었는지 확인합니다(즉, 세포에 대한 급여가 매일 이루어졌는지). • 시약이 신선하게 조제되었는지 확인합니다(즉, 2주 이내 사용되었는지). • 온도 유동성과 광노출을 최소화해야 하므로 플레이트를 배양기 밖에 방치하지 않습니다. • 계대시키는 동안 cm2 당 더 적은 수의 세포 덩어리를 플레이팅하여 콜로니 밀도를 감소시킵니다. • 분화된 영역에 양호한 iPSC 콜로니가 존재할 경우, 피펫 팁을 사용하여 양호한 iPSC 형태를 가진 콜로니를 수동으로 골라내는 것이 고려될 수 있습니다. 권장사항은 여러 개의 콜로니를 선택하고 피펫 팁으로 그것들을 분할한 뒤, 들어올려 흡인하고 신선한 1:6 웰로 옮기는 것입니다. • 완전한 iPSC 콜로니는 남겨둔 채 분화된 영역을 피펫 팁으로 긁어내어 분화된 세포를 제거하는 것이 고려될 수 있습니다. iPSC 콜로니를 흩뜨리지 않도록 주의해야 하며, 이 과정 동안 너무 많은 매트릭스 층을 긁어내지 않도록 합니다.
플레이트 내 불균일한 콜로니 분포	• iPS 세포 밀도가 보이는 영역에서 iPS 세포 밀도가 너무 높음 플레이트 표면의 상당한 영역에서 콜로니가 거의 없거나 아예 없음	• 조직배양 용기의 전체 표면 영역이 적절한 매트릭스로 균일하게 코팅되었는지 확인합니다. • 부드럽게 앞뒤 및 좌우로 흔드는 동작에 의해 세포 덩어리가 고르게 퍼졌는지 확인합니다. • 주의 깊게 배양기에 플레이트를 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다.
세포를 떨어지게 하려면 많이 긁어내야 함	• 1 mL 피펫으로 2-3회 헹궈도 콜로니가 플레이트에서 분리되지 않음	• EDTA의 배양 시간 및 온도가 매트릭스와 맞는지 확인합니다. • EDTA 배양 시간을 증가시킵니다. • 세포 밀집도가 70%를 넘지 않도록 합니다. • 콜로니 내부가 과성장하지 않도록 합니다. 때때로 더 낮은 분할 비율을 이용하여 더 적은 수의 튼튼한 콜로니로 밀집도가 더 낮게 계대시킬 필요가 있습니다.
부착성이 나쁘고 계대 후 세포 사망률이 높음	• 세포가 플레이트에서 분리되며, 계대 직후에는 부착되어 있는 것처럼 보임에도 불구하고 분리됨	• 배지를 교체하기보다는 웰에 신선 배지를 추가하여 충분한 영양 농도를 제공하고, 추가적으로 24시간 동안 세포를 그대로 두어 덩어리들이 완전히 부착되게 합니다. • 배지를 매우 조심스럽게 교체합니다. 배지를 빠른 속도로 추가하면서 생기는 과도한 전단력에 콜로니가 노출되지 않도록 합니다.