Conte cellulari e analisi della salute cellulare

Le cellule in coltura vanno contate per monitorare il tempo di duplicazione e per essere quantificate prima di esperimenti o processi di produzione. Le cellule in coltura richiedono un monitoraggio di routine per la valutazione non solo della proliferazione, ma anche di vitalità, citotossicità e di altri indici di salute cellulare. La scelta del saggio da usare dipende dal tipo di cellule in coltura, dall'applicazione e dal rendimento desiderato. È fondamentale quantificare o contare le cellule in coltura prima della subcoltura o dell'uso in trasfezioni, studi genomici, crioconservazione o altri tipi di manipolazioni.

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Il conteggio manuale delle cellule

Le camere per il conteggio delle cellule come l'emocitometro con griglie Neubauer sono dei comuni dispositivi per il conteggio manuale/visivo delle cellule. Una piccola aliquota di sospensione cellulare viene caricata nella camera di un dispositivo di precisione di vetro smerigliato dotato di una griglia. Per capillarità l’aliquota si disperde sulla griglia. Le cellule vengono visualizzate al microscopio e contate utilizzando un contatore manuale. Il volume noto della camera e il sistema a griglia consentono di calcolare la concentrazione cellulare. Sono disponibili sistemi basati su immagini che automatizzano il processo di conteggio.

Conteggio automatico delle cellule

Molti dispositivi di conteggio automatico delle cellule utilizzano gli stessi coloranti e principi del conteggio visivo utilizzati nell'emocitometro. A differenza dei contatori automatici di cellule basati sul riconoscimento degli oggetti, i dispositivi basati sul principio Coulter hanno guadagnato popolarità grazie alla loro praticità e precisione. I contatori Coulter pompano le sospensioni di cellule attraverso un sensore che rileva le cellule in base a una variazione della resistenza elettrica. Ciò consente un rilevamento più affidabile delle cellule, anche di piccole dimensioni, e un conteggio di alta precisione. I modelli portatili palmari (simili a una pipetta) consentono la conta cellulare diretta sotto cappa.

Saggi di vitalità cellulare

Sintesi del DNA: il monitoraggio della sintesi attiva del DNA nelle cellule è alla base di alcuni saggi di proliferazione cellulare La replicazione del DNA può essere misurata incorporando nucleosidi modificati, come la 3H-timidina radioattiva o la bromodeossiuridina non radioattiva (BrdU) rilevata con un anticorpo.

Attività metabolica: i test colorimetrici che misurano l'attività metabolica sono adatti per analizzare la proliferazione cellulare, la vitalità cellulare e la citotossicità. La riduzione dei sali di tetrazolio come MTT, XTT e WST-1 a composti colorati di formazano avviene solo nelle cellule metabolicamente attive. Anche la presenza di ATP è usata come indicatore dell'attività metabolica. Nel saggio reporter della luciferasi di lucciola, l'ATP prodotto dalle cellule in attiva divisione viene utilizzato per ossidare la D-Luciferina, con produzione di una luce bioluminescente.

Esclusione di colorante: la colorazione con Trypan Blue viene comunemente usata per il conteggio delle cellule vitali. Questo metodo si basa sul principio che le cellule vive non assorbono il colorante, mentre le cellule morte assorbono il colorante e appaiono blu al microscopio.

Saggi di vitalità cellulare in fluorescenza: la 5(6)-carbossifluoresceina diacetato N-succinnimidil estere (CFSE) è comunemente usata per misurare il numero dei cicli di divisione cellulare avvenuti in una data popolazione cellulare. Un altro colorante permeabile alla membrana, la calceina-AM, non è di per sé fluorescente, ma emette una forte fluorescenza verde una volta idrolizzato in una cellula vitale. Al contrario, il colorante nucleare ioduro di propidio (PI) può raggiungere il nucleo solo passando attraverso la membrana danneggiata delle cellule morte. Poiché sia la calceina che il PI-DNA possono essere eccitati con luce a 490 nm, è possibile il monitoraggio simultaneo delle cellule vive/morte con un microscopio a fluorescenza con singola eccitazione.