Inmunohistoquímica

Preparación del tejido, recuperación del antígeno y pretratamiento en la IHC

Normalmente los tejidos se fijan, se incluyen en parafina y se cortan para análisis mediante IHC utilizando un microtomo. Una etapa significativa después de la preparación inicial del tejido es la necesidad de recuperación del antígeno. Es necesario romper los enlaces cruzados proteicos formados durante la fijación y descubrir los sitios antigénicos ocultos. Las condiciones de recuperación del antígeno y de pretratamiento deben determinarse de manera empírica ya que la accesibilidad del epítopo antigénico puede variar significativamente dependiendo de numerosos factores biológicos. Por ejemplo, algunos antígenos pueden requerir un tratamiento más agresivo para «desenmascarar» sus epítopos de unión al anticuerpo, mientras que para otros puede no requerirse pretratamiento alguno. Dos métodos habituales de pretratamiento para recuperación del antígeno son la recuperación termoinducida del epítopo (HIER), en la que se utiliza una fuente de calor junto con tampones y enzimas (proteinasa K). El segundo método, la recuperación del epítopo inducida por proteólisis (PIER), es otro método de recuperación antigénica en el que pueden utilizarse varias proteasas, como la proteinasa k, la tripsina, la quimiotripsina o la pepsina.

Tinción y detección en la IHC

Después de la preparación del tejido y del pretratamiento para recuperación del antígeno, la visualización de la interacción anticuerpo-antígeno puede llevarse a cabo de diversas formas. En el método habitual se utiliza un anticuerpo primario conjugado a una enzima, como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina, que cataliza una reacción productora de color. Por otro lado, en el método de la inmunofluorescencia (IF) se utiliza un anticuerpo marcado con un fluoróforo, como la fluoresceína, la rodamina o Alexa Fluor. Otra opción es emplear un anticuerpo primario no marcado, con detección indirecta del antígeno mediante un anticuerpo secundario marcado o mediante sistemas de detección más complejos. En este caso, deberá determinarse para cada análisis el valor óptimo del anticuerpo primario y del secundario.