Anticorpi secondari
Figura 1.Immunofluorescenza. Tessuto di granulazione esuberante (carne orgogliosa) equino colorato con anti-von Wille.
Gli anticorpi secondari sono anticorpi policlonali o monoclonali che si legano agli anticorpi o a frammenti di anticorpi primari, come le regioni Fc o Fab. Tipicamente essi sono legati a marcatori che li rendono adatti ad applicazioni di rivelazione, purificazione o sorting.
Offriamo anticorpi secondari ottenuti da svariate specie ospiti. I nostri anticorpi secondari policlonali sono prodotti dal siero di animali ospiti come topi, conigli, capre e pecore. Quelli monoclonali sono invece prodotti da cloni di ibridomi di topo.
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Figura 2.Micrografie in fluorescenza di cellule polmonari mitotiche di tritone. Microtubuli colorati con anti-^ monoclonale.
Figura 3.Immunocitochimica. Sezione congelata di nervo ottico di ratto marcato con anti-neurofilamento H di topo e anti-topo di capra coniugato con CF568 (processi neuronali, rosso), anti-GFAP di coniglio e anti-coniglio di capra coniugato con CF488A, altamente specifico (preadsorbito) (cellule gliali, verde). I nuclei sono colorati con RedDot2 (turchese).
Anticorpi coniugati e marcatori
Offriamo un ampio portafoglio di anticorpi coniugati. Un anticorpo coniugato è un anticorpo monoclonale o policlonale legato a un marcatore e utilizzato per la rivelazione in una vasta gamma di tecniche. Lo specifico impiego di un anticorpo secondario dipende dal(i) marcatore(i) a cui è coniugato. I marcatori sono molecole che consentono la rivelazione mediante tecniche diverse. I sistemi di rivelazione più comuni per gli anticorpi secondari coniugati sono di tipo colorimetrico o fluorescente.
I saggi colorimetrici sono tipicamente basati sull'uso di fosfatasi alcalina (ALP) o di perossidasi di rafano (HRP) o suoi derivati. Il sistema coniugato biotina-avidina (streptavidina) viene spesso utilizzato per amplificare il segnale colorimetrico di ALP o HRP. I saggi in fluorescenza più comuni utilizzano l'isotiocianato di fluoresceina (FITC), la rodamina o un suo derivato, l'isotiocianato di tetrametilrodamina (TRITC), la cianina (Cy3) o la ficoeritrina (R-PE).
Offriamo anticorpi coniugati con una varietà di marcatori colorimetrici e fluorescenti, per applicazioni di rivelazione, purificazione, sorting e microscopia. Gli anticorpi coniugati sono ottenuti da diversi animali ospiti, il che li rende compatibili con un'ampia gamma di reagenti immunochimici. Per chi desidera marcare da sé i propri reagenti, offriamo kit per la coniugazione di vari tipi di marcatori (biotina, FITC, CF™) con anticorpi sia monoclonali che policlonali.
Proteine A, G e L
La proteina A è derivata da Staphylococcus aureus, la proteina G da una specie di Streptococcus. Entrambe hanno siti di legame per il frammento Fc delle IgG di mammifero. L'affinità di queste proteine per le IgG varia a seconda della specie animale. La proteina G ha una maggiore affinità per le IgG di ratto, capra, pecora e bovino, nonché per le IgG1 di topo e le IgG3 umane. La proteina A ha una maggiore affinità per le IgG di gatto e cavia (Tabella 1). Oltre ai siti di legame per il frammento Fc delle IgG, la proteina G nativa contiene siti di legame per l'albumina, il frammento Fab delle Ig e le regioni di legame della membrana, il che può comportare aspecificità della colorazione. A questo problema si è ovviato creando forme ricombinanti della proteina. La proteina G ricombinante, progettata in modo da eliminare la regione di legame all'albumina, è infatti una proteina tronca priva dei siti di legame per albumina, Fab e membrana pur mantenendo il sito di legame per Fc, il che la rende più specifica per le IgG rispetto alla forma nativa.
Tabella 1.Capacità di legame delle proteine A, G ed L per diverse specie.
La proteina L, derivata da Peptostreptococcus magnus, ha affinità per le catene leggere kappa (Tabella 2) di varie specie. È in grado di rivelare IgG, IgA e IgM monoclonali o policlonali così come Fab, F(ab′)2 e frammenti variabili a singola catena (scFv) ricombinanti che contengono catene leggere kappa, oltre alle IgG di pollo. N.B. Specie come bovino, capra, pecora e cavallo, le cui Ig contengono quasi esclusivamente catene lambda, legano male, o non legano affatto, la proteina L.
Tabella 2.Legame della proteina L con le catene leggere di varie immunoglobuline.
Reagenti di rivelazione
Le proteine A e G si usano come reagenti generici, non specie-specifici, per legare anticorpi primari o IgG di superficie nei tessuti di mammifero. La proteina G è raccomandata per la maggior parte delle specie, inclusi topo e ratto. La proteina A è consigliata per gatto e cavia. Nessuna delle due è adatta alla rivelazione di IgA o IgM, frammenti Fab o di IgG aviarie. Quando legate a una resina come l'agarosio, la proteina A e la proteina G possono essere utilizzate per la purificazione per affinità delle immunoglobuline presenti nel siero o nel liquido ascitico.
La proteina L si usa come reagente generico per legare anticorpi primari di mammiferi o uccelli o Ig di superficie di qualsiasi classe. È usata in particolare per la rivelazione di frammenti Fab, F(ab′)2 e frammenti scFv ricombinanti, per la rivelazione di Ig legate ai recettori Fc o per la rivelazione di anticorpi monoclonali in presenza di Ig bovine. L'uso è limitato alla rivelazione di Ig contenenti delle catene leggere kappa.
Resine
La proteina A e la proteina G posseggono dei siti di legame per la porzione Fc delle IgG di mammifero. La capacità di legame di queste proteine per le IgG varia a seconda della specie. In generale, le IgG hanno una maggiore affinità per la proteina G rispetto alla proteina A, e la proteina G lega le IgG di un maggior numero di specie. L'affinità delle diverse sottoclassi di IgG, specialmente quelle di topo e di uomo, per la proteina A varia più di quella per la proteina G. La proteina A può quindi essere usata per preparare IgG isotipicamente pure da alcune specie. La proteina L è adatta per isolare anticorpi monoclonali di topo dal surnatante di colture cellulari senza contaminazione da IgG bovine.
Figura 4.CF™ Dye. Cellule HeLa colorate con anticorpo anti-tubulina di topo e anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con CF488A (microtubuli, verde). I filamenti di actina sono colorati con falloidina marcata con CF640R (viola). I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu).
Anticorpi marcati con CF™ Dye
I CF™ Dye sono una serie di coloranti fluorescenti altamente solubili in acqua che coprono lo spettro del visibile e del vicino infrarosso (vicino IR), usati per la marcatura degli anticorpi. Sviluppati con un attenta progettazione da scienziati che utilizzano chimiche innovative, i CF™ Dye sono caratterizzati da luminosità, fotostabilità e selezione dei colori competitive rispetto ad altri coloranti commerciali.
Offriamo anticorpi secondari marcati con CF™ Dye approfonditamente validati in una varietà di opzioni specie-specifiche.
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